当前，青光眼已成为全球不可逆盲的主要病因，以视网膜神经节细胞（RGCs）的进行性凋亡退化和相应的视力丧失为特征，眼内压（IOP）的升高被视为青光眼唯一可调节的风险因素，而降低 IOP 是在临床上证明可以阻止或减缓青光眼进展的方法。碳酸酐酶抑制剂（CAIs）是最古老的降低 IOP 药物之一，主要通过抑制二氧化碳和碳酸之间的相互转换来减少睫状体产生的房水。然而，局部 CAIs 治疗可能存在依从性问题、生物利用度低和副作用等问题，目前也没有迹象表明正在开发新的 CAIs 来解决上述问题。
2024 年 4 月 25 日，来自中山大学的张秀兰团队、剑桥大学的 Patrick Yu Wai Man 团队，共同在 Cell Reports Medicine 上在线发表题为“CRISPR-Cas9-mediated deletion of carbonic anhydrase 2 in the ciliary body to treat glaucoma”的论文，研究团队发现通过 CRISPR-Cas9 技术敲除小鼠睫状体中的碳酸酐酶 2（Car2）基因，能够有效降低 IOP，并在自发性和实验性青光眼模型中减缓或停止青光眼的进展。与现有的 CAIs 药物相比，CRISPR-Cas9 介导的 Car2 基因敲除展现了更显著的治疗效果和潜在的长期益处，为青光眼的基因治疗提供了一种新的策略。此外，安全性评估显示该基因编辑方法未引起显著的不良反应，进一步证实了其作为青光眼治疗方法的潜力。
图 1：相关研究（图源：Cell Reports Medicine）
主要研究内容
1、构建针对 Car2 的高效双靶点 CRISPR 系统
作者针对小鼠 Car2 基因的第 2、3 和 4 外显子设计了六个候选 sgRNA，并将表达 SpCas9 的 ssAAV 载体共转染到 N2a 细胞中。通过 T7E1 酶切法来评估六个 sgRNA 在 N2a 细胞中单独转染时的基因编辑效率，结果提示 sgRNA3 和 sgRNA5 引起的突变最为显著。作者将 sgRNA3 和 sgRNA5 结合到一个 ssAAV 载体中，以最大化编辑效率，T7E1 酶切法显示，双靶点 CRISPR 系统展现了约 97.3% 的高编辑效率，且通过 GUIDE-seq 分析也证实了该系统的低脱靶率。
图 2：构建针对 Car2 的高效双靶点 CRISPR 系统（图源：Cell Reports Medicine）
2、Car2 敲除后可安全有效的降低正常小鼠眼压
作者利用含有 sgRNA3 和 sgRNA5 的 AAV 载体，通过单次玻璃体内注射，针对小鼠的 Car2 基因进行敲除，且经过电泳和荧光成像证实 CAR2 的表达量显著下调。在注射后，对小鼠进行了定期的 IOP 测量，发现 Car2 KO 组的小鼠 IOP 显著且持续地降低。
随后，研究者通过 H&E 和免疫组织化学染色证实小鼠的眼睛形态学并未发生改变，且未观察到明显的免疫细胞浸润。此外，研究者使用 OCT 成像评估视网膜厚度，并使用 ERG 测试评估视觉功能，结果显示 Car2 KO 小鼠的视网膜功能未受损。
图 3：Car2 的敲除可降低正常小鼠的 IOP（图源：Cell Reports Medicine）
3、Car2 的敲除能够降低自发性青光眼模型中的 IOP
为了进一步探讨双靶点 CRISPR 系统介导的 Car2 敲除对青光眼的治疗效果，研究者建立了自发性青光眼模型（DBA/2J 小鼠）。通过定期监测发现，与 C57 小鼠相比，DBA/2J 小鼠从第五个月开始 IOP 逐渐升高，并且在第 8 和第 9 个月时差异更为显著。在通过玻璃体内注射 AAVs 进行 Car2 基因敲除后，对 IOP 进行了连续监测，结果显示 IOP 显著降低。此外，对不同月龄的 DBA/2J 小鼠以及注射 AAVs 的小鼠进行了视网膜神经节细胞（RGCs）染色，结果显示随着年龄的增长，RGCs 的损失逐渐加重，而 Car2 基因敲除能够减缓甚至停止这一现象。
图 4：双靶点 CRISPR 系统介导的 Car2 敲除可有效降低 DBA/2J 小鼠的 IOP（图源：Cell Reports Medicine）
4、在实验性青光眼模型中，Car2 敲除的治疗潜力优于药物治疗
为了进一步研究 Car2 敲除在青光眼治疗中的潜力，作者通过向小鼠眼前房注射磁性微珠构建了慢性眼内压增高（COH）模型。在 IOP 显著升高的第一周，将小鼠随机分配到三个组：COH 组、COH+CAI 组（使用布林佐胺滴眼液，每日两次）和 COH+AAV 组（单次注射 AAVs），同时使用对侧眼作为对照组来计算双目 IOP 差异。结果显示，与 COH 组相比，CAI 组和 AAV 治疗组的减压效果显著，其中 AAV 治疗组在第三周的 IOP 降幅更大。同时 AAV 治疗可以延迟小鼠视网膜变薄，防止 RGCs 的损失。总体而言，与目前临床上常用来治疗青光眼的 CAIs 药物相比，Car2 敲除在降低 IOP 和延缓青光眼进展方面展现出更优越的治疗潜力。
图 5：Car2 敲除和 CAIs 药物治疗在实验性青光眼模型中的比较（图源：Cell Reports Medicine）
总结
本文介绍了一种利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术治疗青光眼的新方法。研究者通过敲除小鼠模型中睫状体内的 Car2 基因，成功实现了显著且持续的 IOP 降低。实验结果表明，该基因编辑策略不仅在正常小鼠中有效，还能在自发性青光眼模型中减缓甚至阻止与长期高眼压相关的视神经损害。此外，与现有的药物治疗相比，Car2 基因敲除展现了更优越的治疗效果，为青光眼患者提供了一种潜在的一次性治疗选择。研究还对 AAV 介导的 Car2 基因敲除的安全性进行了评估，未发现明显的不良反应，验证了该治疗策略的可行性，并为未来的临床应用奠定了基础。
通讯作者资料：
张秀兰
教授、主任医师，博士生导师。从事眼科学临床、科研、教学工作 35 年。连续四年世界青光眼专家排行榜入选前 50 强，其中培养的学生有 9 人次同时入选世界新生血管性青光眼专家排行榜以及世界闭角型青光眼专家排行榜前 50 强。其主要研究方向：青光眼人工智能；高度近视及青光眼影像学；青光眼基因治疗；青光眼微创手术。主持 33 项科研课题。
Patrick Yu Wai Man
剑桥临床视觉实验室的主任，同时在剑桥的阿登布鲁克医院和伦敦的墨菲尔德眼科医院担任名誉顾问。研究方向：视神经病变、神经遗传学和线粒体眼病，主要专注于通过使用患者组织、诱导多能干细胞和动物模型的组合，剖析遗传性视神经病变中导致进行性视网膜神经节细胞损失的疾病机制。
参考资料
[1] Jiang JX et al. CRISPR-Cas9-mediated deletion of carbonic anhydrase 2 in the ciliary body to treat glaucoma. 2024 April 25.
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