来源：市场资讯
瑞士伯尔尼大学植物科学研究所M. T. Raissig为文章通讯作者，R. P. Spiegelhalder和L. S. Berg为文章共同一作。
原文链接：https://doi.org/10.1242/dev.203011
二穗短柄草气孔发育的过程
在植物中，特别是禾本科植物（如文章中提到的模式草二穗短柄草Brachypodiumdistachyon），气孔发育是在特定的细胞文件（cell file）中进行的，这些细胞文件被称为“气孔文件”（stomatal file）。气孔文件是表皮细胞组织中的一系列线性排列的细胞，其中一些细胞具有形成气孔的能力。
二穗短柄草气孔发育的过程涉及到多个关键步骤，包括：
一、气孔母细胞（Guard Mother Cell, GMC）的指定：气孔发育从一个横向不对称的细胞分裂开始，这个分裂产生一个特定的细胞，即气孔母细胞（GMC）。这个细胞将发育成两个保卫细胞（Guard Cells, GCs）。
二、保卫细胞（GCs）的分裂：GMC随后进行一次纵向的对称分裂，形成两个保卫细胞。这两个保卫细胞会发育成独特的哑铃状形态，具有细长的中部（中央杆）和膨大的顶端。
三、附属母细胞（Subsidiary Mother Cell, SMC）的指定与分裂：在GMC分裂的同时，其两侧相邻的细胞文件（即气孔文件）中的细胞被诱导成为附属母细胞（SMC）。SMC随后经历一次不对称的纵向分裂，形成两个附属细胞（Subsidiary Cells, SCs）。
四、气孔复合体的形成：最终，两个保卫细胞和两个附属细胞共同形成了一个四细胞的气孔复合体。这种独特的结构使得禾本科植物的气孔能够迅速开启和关闭，从而高效地控制植物与大气之间的气体交换。
因此，在禾本科植物中，“气孔文件”是指那些包含有可能发育成气孔的细胞（如GMC和SMC）的线性排列的细胞文件。这些细胞文件在气孔发育过程中起着至关重要的作用，通过精确的细胞分裂和分化过程，最终形成功能完善的气孔复合体。
文章内容简介
研究背景与目的：
气孔形态：气孔是叶片表面的微观孔隙，负责控制植物对二氧化碳的吸收和水分的蒸发。禾本科植物（如二穗短柄草）的气孔具有独特的四细胞结构，包括两个哑铃形保卫细胞（GCs）和两个侧翼的副卫细胞（SCs）。
MUTE作用：bHLH转录因子MUTE在禾本科植物中对于SC的形成至关重要，但其对GC发育的调控作用及其移动性对SC招募的影响尚不清楚。
研究目的：本研究旨在通过转基因手段干扰BdMUTE在GC与SC前体细胞间的移动性，探讨其在气孔发育中的具体作用。
实验材料与方法：
植物材料：使用二穗短柄草的野生型（WT）Bd21-3和sid/bdmute-1突变体作为实验材料。
转基因构建：通过GreenGate克隆系统构建了3xGFP-BdMUTE融合蛋白，以评估其移动性和功能。
显微观察与生理测量：利用共聚焦显微镜观察气孔发育过程，并通过叶片气体交换测量评估气孔运动的生理性能。
主要发现：
BdMUTE的双重作用：BdMUTE不仅在GC分裂方向上发挥细胞自主作用，还通过其移动性参与SC的招募，这对于GC的形态发生和快速气孔运动至关重要。
移动性对气孔发育的影响：减少BdMUTE的移动性严重影响了GC和SC发育的时空协调，导致气孔形态异常和生理功能下降。
GC分裂与形态发生：BdMUTE在GC分裂方向上的细胞自主作用对于完整哑铃形GC的形成是必要的，但GC的最终形态还依赖于SC的存在。
生理效应：叶片水平的气体交换测量显示，四细胞气孔结构的剂量依赖性恢复与气孔动力学的逐渐生理恢复相一致。
结论：
本研究表明，BdMUTE在禾本科植物气孔发育中具有双重作用，既调控GC分裂方向又参与SC招募，这对于GC的形态发生和快速气孔运动至关重要。
BdMUTE的移动性对于SC招募和GC与SC发育的时空协调至关重要，进而影响气孔的最终形态和生理功能。
本研究为理解禾本科植物气孔发育的分子机制提供了新见解，并为未来的作物改良提供了潜在靶点。
创新点与意义：
首次在禾本科植物中揭示了MUTE转录因子的双重作用及其移动性对气孔发育的调控机制。
为气孔发育的分子调控网络增添了新的认知，对于理解植物气孔发育的进化适应性和提高作物耐旱性、光合作用效率等方面具有重要意义。
图1. BdMUTE在气孔谱系中的辅助细胞（SC）和保卫细胞（GC）形成中的多重作用？（A）野生型（WT）气孔发育示意图。指出了关于BdMUTE的作用和机制的未决问题。（B）在bdmute中，没有建立辅助母细胞（SMC），也没有发生SC分裂。GMC大多正常分裂，GC对可以形成孔并成熟为功能复合物（上GC，深绿色）。然而，大约有四分之一的GMC显示出倾斜分裂的终止复合体（下GC，灰色）。（C）WT（2 SC）和sid/bdmute-1（1 SC、0 SC和停滞表型）中发现了不同的气孔形态。比例尺=10μm。固定、透明处理和DirectRed 23染色的成熟气孔的中平面共聚焦图像。（D）（E）和（F）中测量的区域示意图；从第一次不对称细胞分裂（蓝色，阶段2）到对称GC分裂（浅绿色，阶段5）。标明了发展阶段；（1） 气孔文件起始，紫色，（2）不对称分裂和GMC形成，蓝色，（3）SMC建立，黄色梯度，（4）SMC分裂，黄色，（5）GMC分裂，浅绿色，（6）GC成熟，深绿色。（E，F）WT和sid/bdmute-1中第一次不对称细胞分裂（ACD，第2阶段）和第一次GMC分裂（GCD，第5阶段）之间的细胞数量（E）和距离（F）。
图2. 迁移受损的3xGFP-BdMUTE的表达以剂量依赖的方式回补sid/bdmute-1表型。BdMUTEp:mCitrine-BdMUTEin sid/bdmute-1 = MYM；BdMUTEp:3xGFP-BdMUTE= M3GM；sid/bdmute-1;BdMUTEp:BdMUTE-mCitrine = MMY；最弱的株系（M3GM--）几乎完全回补了GC终止表型（sid/bdmute-1中25.2%±4.4%的GC终止，M3GM--中2.5%±2.2%的GC终止），但未能诱导额外的SC（图2E，图S2A）。具有较高表达的系（M3GM-、M3GM+）显示其回补SC募集的潜力逐渐增加，超过一半的复合物在M3GM-系中募集至少一个SC，在M3GM+系中募集两个SC的复合物占68.9%±38.8%。（A）显示报告子构建的示意图。单个标记的BdMUTE（sid/BdMUTE-1；BdMUTE:YFP BdMUTE，MYM，黄色+灰色）可以从GMC（蓝色）移动到横向细胞文件（白色）。三重GFP标签（sid/bdmute-1;BdMUTEp:3xGFPBdMUTE, M3GM，绿色+灰色）会损害BdMUTE的移动性，并应将BdMUTE限制在GMC（蓝色）。（B）在sid/bdmute-1背景下的M3GM报告株系中测量的GFP荧光。测量GMC中平面周围的z堆叠的3个切片的平均校正总细胞荧光（CTCF）；所有用恒定激光设置拍摄的图像。（C）MYM和sid/bdmute-1;BdMUTEp:BdMUTE-YFP（MMY）的YFP荧光。测量围绕GMC中平面的z堆叠的3个切片的平均CTCF；所有用恒定激光设置拍摄的图像。（D）（B）和（C）所示线条的第3阶段叶区的代表性中平面共聚焦图像，报告蛋白的信号强度显示为“热图”，碘化丙啶（PI）染色的细胞壁显示为灰色。GMC中的MUTE在四条GFP线中显示出不同的强度，横向细胞文件中的移动信号仅在单标签YFP线中可见。GFP用15%激光和150%增益成像，MYM用12%激光和100%增益成像，MMY用10%激光和150%增量成像。比例尺=10μm。（E）野生型、sid/bdmute-1和（D）中所示的不同sid/bdmite-1回补报告株系的成熟3rd叶中的气孔表型。“中止”描述了具有倾斜GMC分裂或发育中止的复合体。每个基因型n=5-12个个体，每个基因型864-1450个气孔。与图S2中的方框图所示数据相同。（F）本研究中使用的报告株系。
图3. 3×GFP标签降低了BdMUTE的移动性，导致SC招募的时间延迟。（A）sid/bdmute-1;BdMUTEp:YFP-BdMUTE (MYM; top panels)和sid/bdmute-1;BdMUTEp:3xGFP-BdMUTE(M3GM++, bottom panels)的保卫母细胞（GMCs；星形）和侧向辅助母细胞（SMCs；箭头）的代表性图像。细胞用激光强度成像，确保GMC细胞质中的非饱和强度和SMC细胞核中的可见信号。左侧面板为黄色/绿色的YFP/GFP和紫色的碘化丙啶（PI）染色细胞壁，右侧面板为YFP/GFP强度的热图投影；比例尺=10μm。（B）平均SMC核信号和平均GMC细胞质信号的积分密度比。每个基因型n=2-3个个体，每个基因型48-58个气孔复合体（点为气孔）。（C）MYM和M3GM++中第二叶发育区的中平面共聚焦图像；指示未分割（“U”）和分割（“D”）的GMC和现有的SC（箭头）或缺失的SC（！）。细胞壁用PI（品红色）染色，荧光团显示为黄色（YFP）和绿色（3xGFP）。比例尺=10μm。（D）与M3GM++和MYM中的第一个GMC分区相比，GMC在顶部和底部的分区和SC招募状态。每个点代表一个复合体，并根据其相对于第一个GMC分区的位置进行对齐。每列代表一个气孔行（每个基因型n=10个个体）。（E）MYM和M3GM第二叶发育区GMCs的LWR++两侧分别为零个、一个和两个SC。每个基因型n=2-6个个体，每个基因型129-191个气孔。显著差异用不同的字母表示。统计检验：方差分析，然后是Tukey的HSD检验（α=0.05）。
图4. 保护母细胞（GMC）中的低BdMUTE水平主要回补了GMC分裂平面的方向缺陷。（A）wild type (WT), sid/bdmute-1;BdMUTEp:3xGFP-BdMUTE(M3GM--), sid/bdmute-1;BdMUTEp:BdMUTE-YFP (MMY)和 sid/bdmute-1的中最近分割的GMC的代表性图像。碘化丙啶（PI）染色的发育区的中平面共聚焦图像。比例尺=10μm。（B）分裂平面方向测量示意图。绘制一条线，分别连接GMC顶端和基底侧的角（1）。沿着线（2和3）测量从每个角到与GMC分裂平面相交的距离。较小的距离除以较长的距离导致顶端（图S4A，B）和基底侧（图S4C，D）的“偏斜”率。（C）每个GMC的总“偏斜”率是顶端和基底“偏斜”比的总和。总比率<1.6（虚线水平线）表示偏斜的划分（用红点表示）。每个基因型n=7-8个个体，每个基因型66-82个气孔（点为气孔）。显著差异用不同的字母表示。统计检验：方差分析，然后是Tukey的HSD检验（α=0.05）。（D）（C）中描述的分裂表型的示意图。以比值>1.6表示的纵向划分（即所有WT气孔）被用作WT截止值。分割平面方向<1.6和>0的GC被归类为“偏斜”，横向分割显示为比率=0。
图5. 辅助细胞（SC）的存在会影响保卫细胞（GC）的形态。（A）sid/bdmute-1;BdMUTEp:3xGFP-BdMUTE（M3GM-）株系气孔形态的微分干涉对比（DIC）图像，显示与两个、一个或没有SC的复合物（分别为绿色、黄色和蓝色框）。该示意图显示了如何测量这些复合体以计算（B）中的曲率比。比例尺=10μm。（B）M3GM-GC顶点/中间比率处的GC宽度，两侧为零、一或两个SC。比率表示GC的曲率；每个数据点代表一个细胞，如（A）所示对DIC图像进行测量。（C）示意图显示了分析光学截面（如E-G所示）以计算（D）中截面面积的曲率比。（D）M3GM-中具有零、一或两个SC的GC的平均顶点/中间面积比的量化。测量的XZ横截面如（C）所示（见E-G）。每个点代表一个GC。（E-G）M3GM系成熟气孔复合体的3D共聚焦堆叠，不含SC（E），有一个SC（F）和两个SC（G）。通过顶点、中间和YZ截面的XZ横截面由虚线、彩色线和相应的框架显示和指示。比例尺=10μm。共聚焦图像是固定、透明化处理和Direct Red 23染色的气孔。
图6. 生理水平的回补遵循着细胞学水平回补。（A）野生型（WT）; sid/bdmute-1;BdMUTEp:YFP-BdMUTE(MYM), sid/bdmute-1;BdMUTEp:BdMUTE-YFP (MMY) 以及 sid/bdmute-1的绝对气孔导度（gSW）。（B）WT和4个sid/bdmute-1;BdMUTEp:3xGFP BdMUTE（M3GM）株系（++、+、-和-）和sid/bdmute-1的gSW。（C）WT、MYM、MMY和sid/bdmute-1的碳同化（A）。（D）WT、M3GM株系和sid/bdmute-1的A。请注意，A、C和B、D中显示了相同的WT和sid/bdmute-1数据。测量的是3-4周龄的土生植物中最年轻、完全展开的叶子；每个基因型n=5-6个个体，WT为26个个体。灰度条表示光线条件的变化。白色=1000μmolm-2s-1，浅灰色=100μmolm-2s-1，黑色=0μmolm-3s-1。点代表所有个体的平均值，误差条表示标准误差。所示数据用于计算表1和图S6中的稳态值。评估气体交换的成年叶片也用于量化sid/bdmute-1不同回补株系的sid/bdmute-1-突变诱导的气孔形态缺陷的互补性，并计算气孔密度（表1，图S7）。
在这项研究中，作者解决了关于BdMUTE在二穗短柄草SC和GC形成过程中的作用的未决问题（图1）。作者证明，降低BdMUTE的移动性会导致SC招募的时空延迟，这表明BdMUTE移动性确实是招募SC所必需的（图3）。此外，BdMUTE以细胞自主的方式引导GC分裂方向（图4），不需要SC招募（图2）。然而，哑铃GC的完全形态发生需要双侧SC募集（图5）。最后，3xGFP-BdMUTE对sid/bdmute-1中GC和SC的形成的剂量依赖性回补（图2）反映在气孔生理学的逐渐互补中（图6），定量地将气孔解剖学与功能联系起来。GC和SC的不同起源以及二穗短柄草中气孔发育的严格发育梯度使我们能够进一步阐明BdMUTE在草气孔形成过程中的复杂、多方面的作用。
（转自：小麦研究联盟）
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