作者 | 张文萍
审核 | 徐勇
单位 | 深圳市第三人民医院检验医学部
前 言
依据世界卫生组织（ WHO）的标准，实验室诊断是疟疾患者确诊和及时得到治疗的基础。目前实验室疟原虫病原学检查推荐的方法有外周血涂片镜检、首次快速疟原虫抗原检测（Rapid diagnostic test,RDT）和基因检测三种方法[1-4]，其中外周血涂制厚、薄血片吉式或瑞氏染色后，显微镜油镜检测疟原虫是WHO推荐疟疾诊断的“金标准”，不仅能确定疟疾感染和判别疟原虫株，还能识别疟原虫期和原虫密度，协助重症疟疾救治。
快速免疫层析试纸条法（RDT法，简称“金标法”）具有检测简便、快速的特点，不同的试纸条的敏感性和特异性差异很大，其中以恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白（HRP2/HRP3）为靶抗原的诊断试纸对恶性疟检测敏感性和特异性较高，但不能检测其他疟原虫株；
以乳酸脱氢酶（pLDH）为靶抗原的诊断试纸条可检测恶性疟原虫或非恶性疟原虫，但不能鉴别间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫，且对低密度原虫的检测灵敏度稍差，RDT法不能监测抗疟治疗反应[5]；
以 PCR检测技术为主的核酸诊断方法，及近些年快速发展的宏基因检测对虫种的鉴别具有高灵敏度和特异度，但受实验室条件和时间的影响，目前只有疾控中心（CDC）开展；
镜检疟原虫迄今仍是确诊疟疾最快速、最直观、最经济且实用器材简便，结果可靠的方法，因此识别各型别的疟原虫形态是临床检验者的技术活，笔者所在单位为深圳市收治疟疾的定点医院，深圳地理位置特殊，标本相对丰富，有责任分享给同道们。
案例经过
病史：患者，男，49 岁，发热 5 天，2018年6月17日，出现发热，最高体温 40℃，伴畏寒、寒战、乏力，服用退热药物出汗后体温可降至正常，发热时间多为中午，无明显头痛，当时无恶心、呕吐， 精神及食欲均可，前2日就诊于东莞某医院查血常规基本正常，疟原虫阴性，考虑“急性上呼吸道感染”，予口服药物治疗，但患者未服用，仅退热对症处理。
患者当年3月患“登革热”，因此2018年6月20日患者来到我院（深圳市第三人民医院）门诊就诊，体格检查基本正常。
入院后完善相关检查：
①血常规显示：WBC 8.45×109/L，N 75.1%，HGB 103g/L，PLT 87×109/L，散点图异常（粒细胞、有核红、嗜酸性粒细胞区域呈现灰区，红色椭圆圈标注），如下图1：
患者初次血常规（散点图异常）
根据散点图异常，推片、染色、镜检，发现间日疟，报告临床，进一步询问患者近10 余年在柬埔寨生活，曾患疟疾。
②疟原虫检查：间日疟原虫（图2）
图2
③镜检外周血细胞形态：厚血膜镜检找虫体（下图3），薄血膜镜检形态可清晰得辨认可见间日疟原虫的环状体、滋养体、配子体及裂殖体，因此薄血膜可以分型（下图4）：
图3 1例间日疟原虫感染患者厚血膜形态
（溶血瑞氏吉姆萨染色后，放大1000倍镜检）
1、间日疟原虫的裂殖体(通常含裂殖体12-18个）
2、间日疟原虫--图中2个裂殖体+1个配子体+1个小环状体
3、间日疟原虫--图中为1个裂殖体
4、间日疟原虫--图中3个大滋养体（阿米巴样，一伸一缩，胞浆含空泡）
5、间日疟原虫--左边为环状体（小滋养体）、右边为大滋养体
6、间日疟原虫--左边为雌配子体、右边为环状体(约占红细胞体积的1/3)
7、8间日疟雌配子体（发育5-7天才能见到配子体）
9、间日疟雌配子
10、1个红细胞内含2个间日疟的大滋养体
11、12间日疟的大滋养体（红细胞胞浆中有薛氏点）
13、14间日疟的大滋养体
（可见疟色素分布不均一、细小、小杆状、黄褐色、黄中带黑）
15、16间日疟的大滋养体（1个间日疟可见2个核）
图4 患者间日疟原虫感染患者外周血薄血膜形态
（瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
④登革热病毒抗体检查（图5）
图5 患者登革热病毒抗体IgM可疑
⑤流行性出血热病毒IgM抗体检查（图6）
图6
⑥登革热病毒抗原检查（图7）
图7
⑦生化结果（图8）
图8
治疗两天后疟原虫检查结果：金标法（+）、镜检（-）（图9）
图9
治疗三天后血常规结果：散点图恢复正常、血小板上升了20×109/L。（图10）
图10
案例分析
该患者以发热入院，血象表现散点图异常，血小板减少，近 10 余年在非洲、柬埔寨生活的流行病史，当年3 月有患“登革热”，入院次日检测登革热病毒抗体检测IgM可疑、登革热病毒抗原检测(+),因此继发血小板减少症可能是登革热所致[6]。
轻度贫血是感染了疟原虫所致的轻度溶血，生化结果中胆红素均正常，但是乳酸脱氢酶略有增高，可能是疟原虫分泌的pLDH抗原，这也是用药后镜检中找不到了原虫，而金标法却能维持长达三个月阳性(+)，那是因为原虫产生的pLDH抗原与金标pLDH抗体反应形成复合物，在检测区能形成紫红色的条带，因此，我们看到金标法还是阳性（+）时，不要认为患者血液中还有活虫，以镜检和PCR结果为准。该患者在治疗的第三天，血常规的散点图也随着恢复了正常。
治疗：予蒿甲醚抗疟原虫等对症治疗直到三次镜检结果转阴出院，带药：青蒿素哌喹片(免费)，并叮嘱防蚊隔离，需继续抗疟原虫治疗。口服“磷酸伯氨喹片（8 天疗程）”预防寄生在肝细胞内原虫复发，因为当时疾控中心没有此药，患者在8月23日复发，但后来经过系统的治疗后至今未复发，说明磷酸伯氨喹片效果好。
疟原虫检测结果（图11）：
图11
复发血常规散点图再次提示疟原虫感染（图12）：
图12
经过治疗后散点图恢复正常，血小板也上升到正常值（图13）：
图13
经过治疗后9月30日疟原虫检测结果（图14）：
图14
01
分享其他疟原虫形态
① 疟原虫感染常见为间日疟原虫、恶性疟原虫感染
恶性疟原虫的镜检外周血细胞形态：厚血膜镜检找虫体（下图15），薄血膜镜检形态可清晰得辨认可见恶性疟原虫的环状体、滋养体、配子体及裂殖体，镜检薄血膜分型（下图16）：
1.“满天星”样的环状体，每个紫红色的核旁总有蓝色的滋养体
2.新月形的雌配子体、蜡样形雄配子体
3.新月形的雌配子体、蜡样形雄配子体
4.厚血膜中的环状体，每个紫红色的核旁总有蓝色的胞浆
图15 恶性疟原虫感染患者厚血膜形态
（溶血瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
1、红细胞内寄生有恶性疟原虫（小环状体），其中红色箭头：1个环状体有2个核
2、箭头所示的红细胞内寄生有2个环状体的恶性疟原虫，其中1个环状体有2个核
3、箭头所示的红细胞内寄生有1个环状体拥有3个核的恶性疟原虫
4、红色箭头所示的红细胞内寄生有2个环状体的恶性疟原虫
5、恶性疟原虫环状体喜欢贴红细胞边缘生长
6、密度高、体积小的环状体
7、恶性疟原虫雌配子体形态为新月形
8、恶性疟原虫雄配子体形态为蜡样形
图16 恶性疟原虫感染患者薄血膜的各种形态
（瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
②、间日疟原虫、恶性疟原虫形态区别分享：
1、间日疟原虫（图3）：发育的4个阶段均可在外周血中见到，但这种现象很少，通常只能找到大、小滋养体。
恶性疟原虫（图16）：外周血一般见不到大滋养体，只能见到小滋养体（环状体）或配子体，一张片子中要么只见环状体、要么只见配子体（两者只有在病情非常重时才能看到裂殖体）。
2、间日疟原虫：寄生的红细胞变大，环状体体积小通常占红细胞的1/3，通常长在红细胞中间；
恶性疟原虫：寄生的红细胞不变大，环状体体积较间日疟更小，除了在红细胞内出现，还喜欢出现在红细胞的边缘；
3、间日疟原虫：大滋养体出现1个环上2核（形态似戒子上的“红宝石”）的机会非常少，但也见到过（如图4-15、16）；
恶性疟原虫：环状体出现1个“环”（胞质）上有2个核的机会多，有时还可见到3个核（如图16-3）；
4、 间日疟原虫：配子体形态大、圆；
恶性疟原虫：配子体形态为新月形（为雌配子体）、蜡样形（雄配子体）。
5、 间日疟原虫：大滋养体和配子体均能见到疟色素，疟色素分布不均一、细小、小杆状、黄褐色、黄中带黑；
恶性疟原虫：配子体内见到的疟色素金黄色、往往聚集成黑色，旁边有折光；
（间日疟原虫的配子体发育到5-7天容易见到；恶性疟原虫的配子体很少见，因为发育到7-12天才能见到，我科室近15年仅见2例）。
6、 疟原虫密度计算（如下摘自WS/T569-2017）:
6.1 镜检厚血膜，计数每个视野中疟原虫数和白细胞数，计数200个白细胞以上，疟原虫密度很低时，计数1000个；算出疟原虫密度，(疟原虫数量÷白细胞数量）×患者每微升血中WBC计数=疟原虫数/uL血，如果无法进行白细胞计数，以8000个白细胞/微升血计算。
6.2 薄血膜的疟原虫计数法
检测薄血膜，计数每个视野中的疟原虫数和宏细胞数，计数1000个红细胞以上。用下式算出疟原虫密度。（疟原虫数÷红细胞数）×患者每微升血中红细胞数=疟原虫数/微升血。如果无法进行红细胞计数，则以男性5000万个/微升血、女性按450万个/微升血计算。薄血膜的疟原虫计数法适合于疟原虫密度很高时（每微升血中疟原虫数>16000个）的疟原虫计数。
7、 判断用药是否有效的标准：用药6小时密度下降达30%。
③、工作中不能忽视的是卵形疟，卵形疟很少见，受感染者少见，形态难辨，这给检验者尤其夜班一个人，容易漏诊，让患者得不到及时治疗，现将我们发现的卵形疟的报告单、血常规及形态展示如下：
1、疟原虫诊断报告单（图17）：
图17
2、血常规，散点图黑色区提示不正常（图18）：
图18
3、外周血厚、薄涂片呈现的形态（如图19）：
1、厚血膜溶血染色后，卵形疟原虫的裂殖体（绿色箭头）和环状体（红色箭头）
2、薄血膜，寄生卵形疟的红细胞边缘锯齿状、呈拖把形；卵形疟疟色素颗粒粗大、数量少、呈深黄色（该图为本科室同事张仲明拍摄）
图19 卵形疟原虫感染患者厚、薄血膜形态
（瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
总结与心得
分享好的厚、薄血膜（如下图20），好的血膜制片、染色是基础和关键，制片不好，神仙也难倒，记得我在2013年在广东省CDC学习回来后，召集科室员工有空大家一起制片、切磋，当认真得制片上百时，自然就越制越好！想不好都难啊！(Practice Make Perfect!)
图20 左边为薄血膜，右边是厚血膜，
磨砂边处标记编号和日期
尽管现在有许多的检测方法[1-5]，但均不能以常规简便的方法去快速发现，“金标法”灵敏度很高，是检测人体全血样本中恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白（HRPⅡ）和间日疟原虫特有的特异性乳酸脱氢酶(pLDH)，对首诊快速筛选恶性疟原虫和间日疟原虫患者很有帮助，缺陷是“金标法”不能检出卵形疟和三日疟，而且它是检测代谢产物，代谢产物完全降解后才是阴性，一般治疗后会维持3个月阳性，因此，快速简便检测出卵形疟和三日疟只能通过检验工作人员制片、镜检发现，掌握镜检疟原虫的形态在大型医院和基层医院均尤为得重要。
厚血膜能提高检出率平均20倍发现疟原虫、疟色素等[7]，但制片技师是检验工作人员能力的体现，形态说来说去，制片至关重要，黄道连教授常说骨髓片染色的一句话：“染色没染好，神仙都难倒”，用在疟原虫的制片中可以说：“制片没制好，神仙都难倒”，借此机会感谢广东省CDC的潘波和林荣幸教授在2013年举办的疟疾学习班，手把手教会我制作厚、薄涂片，以及各型疟原虫的形态特征，本人学习收获很大。
本文中许多的描述都是那一周镜检学习期间，识别疟原虫时请教林教授给我们讲解的形态特征，虽然他现在已经退休啦，让我们记得这位形态的传授者！
本人所在医院是深圳市收治疟疾的定点单位，制片和识别的技术必须人人过关，不能有闪失，于是我召集本科室成员组织集训，大量刻意练习制片，每个人起初都会有问题，发现当每个人练习到100多张片时，大致就有了感觉，接着就可以带实习学生和新员工，心理上获得成就感就会做得更好。
经过反复练习和严格把控，10几年来我们疟疾镜检阳性率和CDC复片100%符合，就连在我科室里的实习生都可以“露一手”，因此建议刚毕业的检验者加强练习，熟能生巧，本人就如何制作好厚涂片做了大量的试验，得出最佳用血量为4.6μＬ，相应的最佳直径为1.0ｃｍ，以3:7稀释、染色10min和1:9稀释、染色30均能达到最佳染色效果，便于识别疟原虫虫体，提高了检出率，具体操作可以参阅本人在《检验医学与临床》发表了一篇文章“疟原虫厚血膜制作和染色的最佳条件分析”，可在常规试验条件下推广应用[8]。
薄血膜能根据疟原虫形态分型，识别各种疟原虫的形态的工作很有价值,因此特别想分享这篇报道,我们还在新冠爆发期间发现1例卵形疟[9]。当然，对发热和有流行病史的就诊者多留意，即便医生未开单，我们检验者通过血常规的散点图也有发现可疑之处，发现问题，就去请教有经验的老师和向临床沟通、询问病史，我们发表在《热带医学杂志》上的一篇文章《疟疾患者外周血常规指标变化的临床意义》[10]，这篇文章被同行多次引用，伙伴们可以参考一下血常规部分指标的改变及散点图的特征。肯主动制片、镜检，当好临床的侦察兵，应用好检验技能服务好患者，形成医患良性循环，从中获得满足感。
当然，撰写该短篇的主要目的是分享我们宝贵的疟原虫照片和制好厚血膜的技巧，常见的形态较全面，共同道们在遇到可疑的虫体时拿起手机参照就可以放心的发报告。
参考文献：
[1]卢愈新,覃丕恩,潘茂华．等．疟疾快速诊断试剂卡与镜检及乳酸 脱 氢 酶 检 验 结 果 比 较 观 察[J]．中国医药科学，2017,7(16)：7-9．
[2]王加志，李希尚，尹授钦.等.镜检、抗原检测和核酸检测方法在疟疾诊断中的应用比较 [Ｊ]．热带病与寄生虫学, 2020, 18 (1 ):46-48.
[3]李素华，高丽君，张雅兰，等.三种检测方法在疟疾实验室诊断中的比较分析[Ｊ]．河南预防医学杂志,2018,29( 4):252-254(转266）.
[4]WHO guidelines for malaria - 16 October 2023 - World Health Organization (WHO)
[5]国家传染病医学中心(李兰娟、张文宏、黄建荣、高琪）.疟疾诊疗指南[J].中国热带医学,2022,22(8): 575 ~ 586.
[6]刘范伟,徐姗姗,杨益大.82例登革热患者临床资料分析[J].山东医药,2023, 63( 26) :65-68.
[7]孙军.疟原虫色素形成的生物学意义[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2023,41(2):1-4.
[8]张文萍，张仲明，杨燕梅，罗燕婷,等.疟原虫厚血膜制作和染色的最佳条件分析[J].检验医学与临床，2018,15（16）：2379- 2382.
[9]张仲明，符堪和，谢佳斌，余胜，余志勇，张文萍，曲久鑫，等.1例卵形疟原虫合并新型冠状病毒共感染病例报告[J].中国热带医学, 2022,22(1):89-93.
[10]张文萍，蓝贵勉，杨曼影，张仲明,等.疟疾患者外周血常规指标变化的临床意义[J].热带医学杂志, 2017, 17（5）:600- 603（转615）.
说明：本文为原创投稿，不代表检验医学新媒体观点。转载时请注明来源及原创作者姓名和单位。
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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼
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