CRISPR/Cas作为一种革命性的基因编辑工具，正在改变基因治疗的未来。用于治疗镰状细胞病的CasgevyTM在英国和美国获得批准，更加标志着CRISPR/Cas编辑技术迈出了重要的一步。CRISPR/Cas系统进行knock in需要三个组分，其中Cas核酸酶可以通过蛋白质形式递送、合成向导RNA (gRNA) 可以通过RNA形式递送、唯有同源定向修复(HDR)供体模板必须要以DNA形式递送，通常利用重组腺相关病毒（rAAV）载体进行递送。
rAAV载体因其高安全性和有效性而广泛应用于基因编辑中，全球已有八种基于rAAV载体的药物获得批准。然而，rAAV载体中唯一的顺式元件反向末端重复序列（ITR），虽然在基因组复制、包装和转录等过程中起到关键作用，但其内在的转录活性导致没有启动子的转基因也会在体内体外表达。这将使得HDR 供体DNA模板在被rAAV递送时有泄漏表达的可能，从而引发安全性问题。
2024年5月23日，复旦大学生命科学学院凌晨研究员课题组，在《Nucleic Acids Research》期刊上发表题为“rAAV capsid mutants eliminate leaky expression from DNA donor template for homologous recombination”的论文。在这项研究中，研究人员首次发现提出了来自于同源重组臂和ITR的启动子作用共同导致了rAAV载体于体内和体外递送HDR 供体DNA模板时会有泄漏表达。为了解决这个问题，研究人员鉴定出多种新的 rAAV 变体，其中 Y704T变体最为突出。它不仅具有高产量的特点，还能有效抑制由强启动子驱动的mRNA 转录。Y704T 变体在受体相互作用、细胞内运输、核进入、脱壳和第二条链合成方面具有正常功能，但特别表现出转录缺陷，从而导致表达近乎关闭。重要的是，这种抑制作用与 ITR、启动子类型和 RNA 聚合酶无关。有意思地是，Y704T变体包装的DNA本身具有转录能力，提示上述抑制作用和外壳蛋白息息相关，接着研究人员发现Y704T变体只能通过衣壳蛋白顺式调控转基因转录，但和DNA甲基化、组蛋白甲基化无关。机制研究发现Valosin 含有蛋白 (VCP/p97)抑制剂DBeQ可以在体内和体外特异性提高Y704T突变体的表达，揭示了VCP/p97参与衣壳介导的转基因转录抑制。最重要的是，研究人员证明Y704T变体和野生型rAAV载体所递送的HDR 供体DNA模板具有相同的复制能力和同源重组效率。
综上所述，该研究首次提出HDR 供体DNA模板的泄漏表达由同源重组臂和ITR共同导致。进一步，该研究不仅开发了新的rAAV载体解决泄漏表达问题，还为探索“rAAV载体外壳蛋白影响转基因表达”这一全新理论奠定了实验基础。
Abstract
Precise genomic editing through the combination of CRISPR/Cas systems and recombinant adeno-associated virus (rAAV)-delivered homology directed repair (HDR) donor templates represents a powerful approach. However, the challenge of effectively suppressing leaky transcription from the rAAV vector, a phenomenon associated to cytotoxicity, persists. In this study, we demonstrated substantial promoter activities of various homology arms and inverted terminal repeats (ITR). To address this issue, we identified a novel rAAV variant, Y704T, which not only yields high-vector quantities but also effectively suppresses in cis mRNA transcription driven by a robust promoter. The Y704T variant maintains normal functionality in receptor interaction, intracellular trafficking, nuclear entry, uncoating, and second-strand synthesis, while specifically exhibiting defects in transcription. Importantly, this inhibitory effect is found to be independent of ITR, promoter types, and RNA polymerases. Mechanistic studies unveiled the involvement of Valosin Containing Protein (VCP/p97) in capsid-mediated transcription repression. Remarkably, the Y704T variant delivers HDR donor templates without compromising DNA replication ability and homologous recombination efficiency. In summary, our findings enhance the understanding of capsid-regulated transcription and introduce novel avenues for the application of the rAAV-CRISPR/Cas9 system in human gene therapy.
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