J Virol. | OAS1通过募集TRIM21降解病毒主要衣壳蛋白来抑制ASFV复制|t细胞|介导|内源性|猪流行性腹泻病毒|蛋白|驯养动物

中国农业科学院兰州兽医研究所殷宏、牛庆丽研究员团队于2023年10月在Journal of Virology上发表了题为“OAS1 suppresses African swine fever virus replication by recruiting TRIM21 to degrade viral major capsid protein”的研究论文。

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种高度传染性的猪致死性病毒性疾病，极大地威胁了中国动物健康和养猪行业。研究宿主与病毒的相互作用对于开发新的抗ASFV策略至关重要。2′，5′-寡腺苷酸合成酶基因1（OAS1）是一种关键的干扰素刺激基因（ISG）效应蛋白，可促进先天抗病毒反应。本研究提供了OAS1显著上调并抑制ASFV感染的证据。过表达OAS1可以促进JAK-STAT通路的激活，增强STAT1和STAT2的磷酸化，从而促进先天性免疫反应和宿主的抗病毒策略。另外的机制研究表明，ASFV基因组中富含AT的dsDNA被RNA聚合酶III转化为dsRNA。因此，OAS1在感知dsRNA后被激活，产生OAS，从而激活RNase L的抗病毒功能，进一步降解病毒衍生的mRNA。此外，OAS1与P72直接相互作用，募集TRIM21以K63为主要泛素位点，形成降解P72的多泛素化链，从而抑制ASFV的复制和的成熟病毒粒子的组装。此外，P72还可以阻止DDX6和OAS1之间的相互作用，抑制avSG的产生和宿主的抗病毒能力。作者的研究发现了OAS1通过与病毒蛋白P72相互作用，影响avSG的形成，诱导宿主的抗病毒反应，并控制ASFV的复制，从而确定了OAS1的新作用，揭示了ASFV感染过程中的机制和内在调控关系。

结果一：OAS1在ASFV感染时上调并抑制ASFV在PAM和MA104细胞中的复制

为了研究ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)过程中OAS1表达的动态变化，将ASFV(CN/SC/2019)以MOI=1感染原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)，分别于感染后12、24、36、48小时(HPI)观察OAS1表达的变化。通过Western blotting和RT-qPCR检测OAS1的表达。ASFV感染后OAS1的表达和转录略有增加(图1A和B)。接下来，作者研究了ASFV感染对OAS1表达的影响。PAM仅感染ASFV(MOI=1，PC)、感染经紫外线照射(UV)或热灭活(Heat)的ASFV、感染不同MOI(0.1、1、2)的ASFV或未感染ASFV(NC)。OAS1的蛋白表达和mRNA水平没有明显变化(图1C和D)，并随着ASFV MOI的增加而增加(图1E和F)，表明ASFV复制是OAS1上调表达所必需的。

表达ASFV主要结构蛋白P72和P30以检测ASFV的复制。Western blotting、RT-qPCR分析和HAD50实验表明，OAS1的过表达以时间依赖的方式(图2A和B)和剂量依赖的方式(图2C至E)抑制ASFV的复制。

为了进一步确定OAS1对ASFV复制的影响，将siRNA-OAS1基因转染PAM或MA104细胞24 h或36 h，检测病毒蛋白、RNA水平和病毒载量。将siRNA干扰PAM或MA104细胞24 h后，通过HAD50实验以评估OAS1对ASFV复制的影响。与si-NC对照组相比，siRNA介导的OAS1基因敲低显著增加了MA104(图2F至H) 或PAM细胞(图2J至L)中ASFV P72(B646L)的蛋白表达和转录水平，但对的早期病毒蛋白P30(CP204L)几乎没有影响，尤其是在24 hpi时。HAD50实验表明，siRNA干扰后的ASFV复制在MA104细胞(图2I)和PAM细胞(图2M)中也显著增加。

结果二：OAS1激活NF-κB通路而不激活IFN通路，并促进JAK-STAT激活

研究报告表明，ASFV基因组中富含AT的区域可以通过Pol-III-RIG-I轴介导dsDNA到dsRNA的转变来激活先天抗病毒反应。OAS1可以识别dsRNA产生OAS，从而激活核糖核酸酶L（RNase L），并发挥抗病毒作用。然后dsRNA可以通过Toll样受体(TLR)募集特异性胞内接头蛋白启动级联来激活NF-κB。

为了研究OAS1在激活NF-κB中的作用，作者对OAS1和ASFV基因组中富含AT的区域激活NF-κB进行了实验。将pFlag-OAS1或带有p-ISRE、p-IFN-β或p-NF-κB双荧光素酶报告质粒的空白载体转染HEK-293T或MA104细胞。转染24 h后（hpt），以转染dsDNA模拟物poly(dA：dT)或dsRNA模拟物poly(I：C)为对照。双荧光素酶报告基因实验表明，OAS1可以激活HEK-293T细胞或MA104细胞中的NF-κB启动子，但不能激活IFN-β启动子和ISRE启动子(图3A和B)。同样，ASFV基因组中富含AT的区域也可以激活两种细胞系中NF-κB的启动子(图3C和D)。然而，POL-III抑制剂ML-60218能够抑制poly(dA：dT)刺激下富含AT的区域和NF-κB启动子的激活，但对poly(I：C)刺激没有显著影响(图3D)。ASFV基因组中富含GC的区域不能激活NF-κB启动子(图3C和D)。此外，在ASFV感染下，OAS1还可以促进NF-κB的激活(图3C)。

为了进一步分析ASFV感染过程中OAS1对上游JAK-STAT通路的激活作用，将pFlag-OAS1或空白载体分别转染MA104细胞24 h，然后再感染ASFV （MOI=1）24或48 h。Western blotting和RT-qPCR结果表明，在ASFV感染下，OAS1过表达可显著促进STAT1/2的表达和磷酸化，且呈剂量依赖性(图4A和B)。RT-qPCR结果表明，OAS1的过表达可以促进MA104和PK-15细胞中STAT1/2的转录(图4C至F)。此外，在PK-15细胞中过表达OAS1还可以刺激RNase L、P53、NLRP3、NF-κB、MDA5、MAVS、MAPK、Caspase1、IRF3等免疫途径分子的转录。上述结果表明在ASFV感染过程中，OAS1可以促进JAK-STAT通路的激活，进而激活先天免疫途径，发挥抗病毒作用。

结果三：OAS1通过RNase L依赖性机制促进先天免疫反应抑制ASFV复制

结果四：OAS1与ASFV病毒主要衣壳蛋白P72特异性相互作用

为了进一步阐明OAS1抑制ASFV复制的可能分子机制，作者首先假设OAS1可能与ASFV的病毒蛋白或宿主蛋白相互作用来抑制ASFV的复制。为证实这一点，在感染ASFV(MOI=1)24 hpi的PAM细胞中加入OAS1抗体，进行免疫共沉淀(Co-IP)分析，然后采集样品进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。作者发现P72蛋白在Co-IP后的丰度最高。随后，构建了相应的表达载体pHA-P72。通过外源性和内源性验证，对MA104和PAM细胞中OAS1和P72的相互作用进行Co-IP。结果表明pFlag-OAS1和内源性OAS1可与P72相互作用(图6A至D)。此外，纯化His-P72蛋白和GST-OAS1蛋白用于GST下拉实验。Western blotting表明OAS1可以直接与P72蛋白相互作用(图6E)。接下来，作者进行了共聚焦显微镜检查，以确定OAS1是否与P72在PAM和HEK293细胞中共定位，发现OAS1存在于细胞质中并与P72共定位(图6F和G)。

作者进一步确定OAS1和ASFV P72中哪些结构域对它们的相互作用至关重要。根据前述结构特征构建了P72的截短片段，包括5个N-Loops，其中Loop1具有N-末端突起，β链延伸从1到195 aa；N-Loop2的N-末端突起从199到332 aa；N-Loop3的N-末端突起从355到417 aa；C-Loop1具有C-末端突起，β-链延伸从439到543 aa；C-Loop2具有C-末端突起，β链延伸从550到628 aa(图6H)。根据其特点，OAS1截短区由5个片段组成，核苷酸转移酶(NT)结构域为1至207 aa，N端dsRNA结合位点为9至54 aa，NT和CT结构域重合部分为181至207 aa，CT结构域为201至349 aa，NT和CT连接区为319至340 aa。将构建的OAS1和P72的截短体或P72或OAS1的全长作为对照，共转染或单转染HEK-293T细胞24 h。Co-IP结果表明，P72全长可与OAS1的NT结构域(1-207 aa)及NT和CT结构域重合部分(181-207 aa)的截短片段相互作用(图6I)，而OAS1全长可与P72截短的N-Loop1、N-Loop3和C-Loop2相互作用(图6J)。这些结果表明，OAS1（主要是OAS1的NT结构域）与ASFV的主要衣壳蛋白P72相互作用。

结果五：OAS1促进TRIM21介导的P72蛋白酶体降解

为了进一步研究OAS1在ASFV复制过程中的潜在机制，作者研究了OAS1是否会减少ASFV复制以及P72的表达。构建pFlag-OAS1和pHis-P72两种表达载体，使用剂量增加的pFlag-OAS1和单一浓度的pHis-P72共转染HEK-293细胞。Western blotting结果显示，与只转染P72质粒相比，OAS1可剂量依赖性地降低P72的表达(图7A)。

为了进一步探讨OAS1抑制P72表达的降解途径，将pFlag-OAS1和pHis-P72共转染细胞，在24 hpt时分别加入蛋白酶体抑制剂MG-132、溶酶体抑制剂NH4Cl或自噬抑制剂3-MA。Western blotting结果显示，与未转染Flag-OAS1质粒组相比，转染Flag-OAS1质粒组的P72表达水平显著降低；与二甲基亚砜(DMSO)处理组相比，MG-132处理组的P72表达水平部分恢复，而3-MA处理组对HA-P72的降解有轻微的抑制作用，NH4Cl对HA-P72的降解没有明显的恢复作用(图7B)。综上结果表明，OAS1主要通过蛋白酶体途径降解P72。

作者推测OAS1募集其他分子来降解P72。通过分析Co-IP/LC-MS/MS的数据，作者发现了一种泛素相关分子TRIM21，这是一种E3泛素连接酶，在病毒感染的各种方式中发挥限制病毒复制的作用。为了确定TRIM21是否参与OAS1诱导的P72降解，将pFlag-OAS1、pHis-P72和pMyc-TRIM21共转染HEK-293T细胞。Co-IP和Western blotting表明ASFV P72能与OAS1和TRIM21相互作用，但TRIM21只有在P72存在的情况下才能与OAS1相互作用(图7C和D)。随后，纯化His-P72、Myc-TRIM21和GST-OAS1蛋白进行GST下拉实验。Western blotting表明，OAS1不能与TRIM21直接相互作用，而只有在P72存在的情况下才能相互作用(图7E)。共聚焦显微镜分析表明，OAS1、P72和TRIM21共定位于细胞质中，TRIM21与P72聚集在同一位置，呈点状聚集分布。然而，OAS1很少与TRIM21聚集在细胞质中相同的位置，表明OAS1不与TRIM21相互作用(图7F)。这些结果表明，OAS1在P72存在的情况下募集TRIM21形成蛋白质复合物。

结果六：OAS1募集TRIM21来介导K63位点连接的P72泛素化

为了进一步解决OAS1募集TRIM21降解P72的问题，将pHis-P72、pMyc-TRIM21和pHA-Ub质粒共转染HEK-293T细胞。Western blotting结果显示，Ub可剂量依赖性地抑制P72的表达，而MG-132可抑制这种作用(图8A)。为了确定TRIM21是否能导致P72泛素化，以及TRIM21催化P72结合的多泛素链类型，构建了pHA-Ub WT和7个保留突变的Ub质粒(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，并与pFlag-OAS1、pHis-P72和pMyc-TRIM21共转染HEK-293T细胞。Western blotting结果表明，在K6、K11、K29、K33、K48和K63泛素分子存在的情况下，TRIM21增加了P72的泛素化水平(图8B)，表明TRIM21能够形成多泛素化链来促进P72的泛素化。

为了进一步确定TRIM21促进P72泛素化的主要位点，将pFlag-OAS1、pHis -P72和pMyc-TRIM21与K6、K11、K29、K33、K48或K63质粒共转染HEK-293T细胞，在存在或不存在pMyc-TRIM21的情况下进行Co-IP，以评估TRIM21主要作用的泛素位点。Western blotting结果表明，转染或未转染pMyc-TRIM21显著影响了P72在K63位点的泛素化(图8C和D)，表明TRIM21介导了K63位点连接的P72泛素化。

结果七：P72抑制OAS1和DDX6之间的相互作用从而抑制SG组装

据报道，OAS1是应激颗粒SG的组成部分之一。在暴露于外部刺激后，OAS1被募集到SG中以抵抗外部刺激。据报道DDX3X、DDX6和Caprin1也是SG的一部分，作者在OAS1的Co-IP/LC-MS/MS数据中成功筛选出这些分子。为了探索OAS1介导的SG组装的分子机制，作者发现G3BP1和OAS1可以共定位于细胞质中，与亚砷酸钠（SA）处理组相比，ASFV感染后SG的产生受到抑制(图9A)。随后，为了研究OAS1与DDX3X、DDX6和Caprin1的相互作用在P72介导的ASFV感染中的作用，通过共聚焦显微镜分析了DDX6、DDX3X、Caprin1与OAS1或G3BP1之间的内源性共定位，并分别在SG中与OAS1共定位(图9D、G和J)，构建表达载体pMyc-DDX3、pMyc-DDX6或pMyc- Caprin1，并共转染HEK-293T细胞24 hpt，通过Co-IP分析三者之间的相互作用。结果表明，OAS1可与DDX3X、DDX6、Caprin1相互作用(图9B、E和H)。将带有Flag-OAS1的质粒pMyc-DDX3X、DDX6或Caprin1和以剂量递增的P72转入HEK-293T细胞24 hpt，通过Co-IP验证它们相互作用的影响。结果表明，P72以剂量依赖性方式抑制OAS1与DDX6的相互作用，但不影响OAS1与Caprin1或DDX3X的相互作用(图9C、F和I)。作者通过MOI增加的ASFV感染PAM，进一步确定ASFV P72对OAS1和DDX6相互作用的影响。在内源性验证中也观察到了类似的结果，ASFV感染可以抑制OAS1和DDX6之间的相互作用(图9K)。这些结果表明，P72通过干扰DDX6和OAS1之间的相互作用来抑制SG的组装。

小结

综上，作者提出了OAS1通过多种机制在抑制ASFV复制中的调控作用的工作模型（图10）。首先，在ASFV感染后，OAS1促进STAT1/2的表达和磷酸化，激活JAK-STAT通路，从而激活先天免疫应答。其次，ASFV-AT富集的dsDNA被RNA POL-III转化为dsRNA。因此，OAS1在感知dsRNA后被激活，产生OAS，从而激活RNase L的抗病毒功能，进一步降解病毒衍生的mRNA。第三，ASFV感染可抑制SG的产生。募集OAS1、DDX3X、DDX6和CAPRIN1等分子以形成SG并具有对ASFV侵染的抗性。ASFV的主要结构蛋白P72抑制OAS1与DDX6的相互作用和SG的抗病毒作用。第四，OAS1可以与ASFV的主要结构蛋白P72相互作用，通过泛素-蛋白酶体途径募集TRIM21降解K63位点的P72，进一步破坏ASFV成熟颗粒的组装，减少成熟病毒粒子的产生。作者的发现为ASFV和宿主相互作用之间的关系提供新知识，为开发抗ASFV的药物靶点提供新思路。