Autophagy. | 猪繁殖与呼吸综合征病毒通过SQSTM1/p62依赖性选择性自噬降解DDX10以拮抗其抗病毒活性|介导|呼吸综合征|基因改造病毒|抗病毒|活性|细胞|蛋白|雷帕|驯养动物

华中农业大学周艳荣课题组在Autophagy上发表的题目为“Porcine reproductive and respiratory syndrome virus degrades DDX10 via SQSTM1/ p62-dependent selective autophagy to antagonize its antiviral activity”的文章，作者的研究揭示了PRRSV通过选择性自噬逃避宿主抗病毒先天免疫的新机制，为开发抗PRRSV药物提供了新的靶点。

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结果1：调节PRRSV增殖的DDX的筛选

为了全面评估各种DDX对PRRSV感染的潜在影响，用编码40种不同DDX中每种DDX的表达质粒转染MARC-145细胞组，随后用rPRSRSV-EGFP感染，然后进行流式细胞术测定，以测量EGFP的表达水平，作为PRRSV增殖的读数（图1A）。RIGI，一种众所周知的抗病毒DDX和DDX18，一种已被证明可促进PRRSV感染的DDX，分别被设定为阳性对照和阴性对照。与先前研究的结果一致，与空载体转染的细胞相比，在DDX18转染的细胞中观察到PRRSV复制水平较高，而在RIGI转染的细胞中PRRSV的复制水平较低。作者发现DDX10和DDX49显著抑制PRRSV的增殖，而DDX4、DDX21和DDX27显著促进PRRSV增殖（图1B和1C）。随后，进行定量病毒基因组RNA水平的qRT-PCR，以证实这五种DDX对PRRSV感染的影响，结果与流式细胞术数据非常一致（图1D）。DDX10和DDX49都表现出与阳性对照RIGI相似的潜在抗PRRSV活性，作者随后重点研究了DDX10。

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结果2：DDX10负调控PRRSV感染

为了进一步阐明DDX10在PRRSV增殖中的作用，收集细胞进行qRT-PCR、蛋白质印迹和TCID50测定。结果显示，在所有测试时间点，DDX10的异位表达显著下调了病毒基因组RNA的拷贝数（图2A）、PRRSV N蛋白的表达水平（图2B）和TCID50（图2C）。通过使用siRNA研究了DDX10敲除对PRRSV感染的影响。设计了三种DDX10特异性siRNA，并选择siDDX10-2（以下简称为siDDX10）用于随后的实验，因为它具有最高的敲除效率（图S2A和S2B）。用siDDX10或阴性对照siRNA（NC）转染iPAM 24小时，然后用PRRSV感染。结果显示，敲低DDX10显著上调了病毒基因组RNA的拷贝数（图2D）、PRRSV N蛋白的表达水平（图2E）和TCID50（图2F），从而进一步证明DDX10抑制了PRRSV的复制。

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结果3：DDX10促进IFNB的产生和ISG的表达

一些DDX具有抗病毒活性，主要通过调节IFN-I的产生或与病毒蛋白的相互作用发挥作用，PRRSV对IFN-I高度敏感。因此，评估了DDX10对IFNB产生的影响，以初步研究DDX10的潜在抗PRRSV机制。为此，用pCAGGSFlag-DX10转染iPAM，然后用qRT-PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测猪IFNB的mRNA和蛋白表达。结果显示，DDX10的过表达显著上调了IFNB的mRNA（图3A）和蛋白（图3B）水平。作者还检测到DDX10对启动子的影响IFNB的活性。用pCAGGSFlag-DX10和用于IFNB启动子的萤火虫萤光素酶报告质粒（IFNB-Luc）以及雷尼拉萤光素酶报道质粒pRL-TK（作为内部对照）共转染iPAM，然后在双萤光素酶测定中评估。结果显示，DDX10的过表达强烈激活了IFNB启动子活性（图3C），进一步证实了DDX10诱导IFNB的产生。IFNB的诱导需要转录因子IRF3和NFKB的协同作用。用萤光素酶报告质粒IRF3-Luc和NFKB-Luc进行的双萤光素酶报道基因测定的结果显示，DDX10的异位表达激活了IRF3和NFKB（图3D和3E）。此外，DDX10显著上调IRF3（p-IRF3）和NFKB亚基RELA/p65（p-RELA/p65%）的磷酸化水平（图3F），这是IRF3和NFKB激活的标志，从而进一步证明DDX10正向调节IFN-I的产生。干扰素α和IFNB的抗病毒作用主要是由于诱导了大量的ISG，因此进一步研究了DDX10在PRRSV感染时调节IFNB和ISG诱导的功能。在PRRSV感染后的所有测试时间点，DDX10敲低显著下调IFNB（图3G）、MX1（图3H）和IFIT2/ISG54（图3I）的mRNA表达水平，以及ISG15、IFITM3和OAS1（图3J）的蛋白表达水平。总之，这些结果表明，DDX10的抗PRRSV活性至少部分与其诱导IFN-I产生和ISG表达的能力有关。作者随后检测了人DDX10对HEK-293T细胞中IFNB产生和信号转导的影响。结果显示，人DDX10的过表达显著增加了IFNB的mRNA和蛋白质水平，以及IFNB、IRF3和NFKB的启动子活性（图S3A–S3E），而在用人DDX10-特异性siRNA转染的细胞中发生了相反的作用（图S3F–S3I）。此外，用特异性siRNA敲低人DDX10抑制了乙型副流感病毒（SeV）诱导的IRF3和RELA的磷酸化水平，以及ISG15、IFITM3、OAS1、MX1和IFIT2的表达（图S3J–S3L）。基于这些来自不同物种的数据，作者得出结论，DDX10正调节IFN-I。

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结果4：PRRSV感染下调DDX10的表达并促进其细胞质易位

由于DDX10表现出较强的抗PRRSV活性，作者想知道PRRSV是否也调节DDX10。为此，作者首先分析了PRRSV感染后DDX10的蛋白表达。结果显示，PRRSV感染在所有三个时间点下调了DDX10蛋白的表达（图4A），并且这种下调以剂量依赖的方式发生（图4B）。值得注意的是，作者发现PRRSV感染后DDX10的mRNA表达水平没有降低（图4C），这表明DDX10蛋白表达的降低可能是由于翻译后修饰或降解。然后作者研究了PRRSV对DDX10亚细胞定位的影响。通过IFA检测内源性DDX10的亚细胞定位。结果显示，PRRSV感染导致DDX10从细胞核部分易位到细胞质（图4D）。进行了细胞核和胞质分级分析，结果显示，与模拟感染细胞相比，PRRSV感染细胞的细胞质DDX10表达水平更高，细胞核DDX10的表达水平更低（图4E），这与IFA的结果一致（图4D）。总之，这些结果表明，PRRSV感染降低了DDX10的蛋白质表达，并促进了其细胞质易位。

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结果5：PRRSV感染通过自噬途径降解DDX10

细胞凋亡、自噬和泛素-蛋白酶体系统是三种主要的细胞内降解途径。为了确定PRRSV降解DDX10的途径，用PRRSV感染iPAM，然后分别用Z-VAD-FMK（凋亡途径抑制剂）、氯喹（CQ）和NH4Cl（自噬途径抑制剂）以及MG132（泛素-蛋白酶体途径抑制剂）处理。蛋白质印迹结果显示，用CQ或NH4Cl处理几乎完全恢复了DDX10水平（消除了PRRSV诱导的降解），而与对照二甲基亚砜（DMSO）处理相比，在用Z-VAD-FMK或MG132处理的情况下，DDX10的水平没有观察到明显差异（图5A-5C），这表明自噬途径在PRRSV感染期间的DDX10降解中起主要作用。为了进一步巩固这一结论，作者检测了DDX10在暴露于雷帕霉素（一种自噬诱导剂）的iPAM中的蛋白质表达水平。与上述结论一致，雷帕霉素处理以剂量依赖性方式下调DDX10蛋白表达水平（图5D），NH4Cl可以部分恢复该水平（图5E）。总之，这些结果表明，PRRSV感染通过自噬途径降解DDX10，而DDX10本身可以通过自噬进行调节。由于雷帕霉素诱导的自噬导致DDX10降解（图5D和5E），并且PRRSV感染促进DDX10从细胞核易位到细胞质进行降解，因此DDX10的降解似乎可能发生在细胞质中。为了证实这一推测，用pCAGGS-Flag-DDX10转染iPAM，然后用雷帕霉素处理，然后进行细胞核和胞质分级测定。细胞质中DDX10的蛋白质水平被雷帕霉素下调处理，而细胞核中的DDX10水平没有明显变化（图5F），表明DDX10的自噬降解主要发生在细胞质中。自噬降解的内容物首先在自噬体内，然后输送到溶酶体进行降解。为了进一步证明DDX10的降解依赖于自噬，检测了DDX10与自噬体标记物（LC3）以及溶酶体标记物（LAMP1）的潜在共定位。内源性DDX10与细胞质中的GFP-LC3和LAMP1 DsRed部分共定位（图5G和5H），表明DDX10可以与自噬体和溶酶体共定位进行自噬降解。

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结果6：PRRSV E蛋白与DDX10相互作用并诱导DDX10细胞质易位

为了进一步研究PRRSV和DDX10之间的关系，作者筛选了PRRSV编码的蛋白质与DDX10的潜在相互作用。HEK-293T细胞是用编码PRRSV蛋白的pCAGGS-Flag-DDX10和HA标记的表达构建体转染，然后进行共免疫沉淀（CO-IP）测定。结果显示，在用抗-Flag抗体分离的免疫复合物中只能检测到E蛋白（图6A和图。S5）。在反向共IP实验中，DDX10也通过抗HA抗体与E蛋白有效地共免疫沉淀（图6B）。作者进一步评估了DDX10是否与E蛋白共定位，IFA结果显示，在细胞质中可以看到过表达的DDX10与E蛋白的一些共定位。值得注意的是，作者还发现E蛋白的过表达导致DDX10从细胞核部分易位到细胞质（图6C），如在PRRSV感染的细胞中观察到的（图4D）。为了进一步证实这一结果，进行了细胞核和胞质分级测定。E蛋白和DDX10的共表达导致细胞质DDX10增加和细胞核DDX10减少，表明E蛋白将DDX10从细胞核重新分布到细胞质（图6D）。作者进一步研究了内源性DDX10在表达E蛋白的细胞中的亚细胞定位。结果表明，E蛋白促进了内源性DDX10从细胞核转移到细胞质，其中易位的DDX10与E蛋白共定位（图6E）。

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结果7：PRRSV E蛋白促进DDX10的自噬降解

因为作者发现PRRSV感染通过自噬途径降低了DDX10的表达（图5），接下来研究了PRRSV E蛋白对DDX10表达和自噬的影响。结果显示，E蛋白的过表达在蛋白水平上剂量依赖性地降低了外源性和内源性DDX10的表达（图7A和7B），但在mRNA水平上没有（图7C）。同时，发现E蛋白增加LC3-II的水平（图7A和7B），并促进GFP-LC3点的形成（图7D），表明E蛋白诱导自噬。因此，进一步探讨了自噬是否参与E蛋白介导的DDX10降解。首先，使用NH4Cl来阻断自噬途径，结果显示，NH4Cl在很大程度上挽救了E蛋白诱导的DDX10表达的减少（图7E），这表明自噬参与了E蛋白介导的DDX10降解。为了进一步强化这一结论，使用了必需自噬基因ATG7和ATG5的HEK-293T敲除细胞，以下分别称为ATG7 KO和ATG5-KO，发现E蛋白诱导的DDX10降解在野生型（WT）HEK-293T细胞中可检测到，但在ATG7-KO或ATG5-KO细胞中均未检测到（图7F和7G）。总之，这些数据表明PRRSV E蛋白介导的DDX10降解依赖于自噬。

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结果8：PRRSV E蛋白以SQSTM1依赖的方式诱导DDX10的自噬降解

蛋白质聚集体的自噬清除是一个高度选择性的过程，取决于货物受体对底物的识别。为了确定DDX10的自噬降解需要哪些货物受体，进行了CO-IP测定，以检测DDX10与货物受体SQSTM1、NBR1、OPTN、TOLLIP和BNIP3L/NIX之间的相互作用。在这些受体中，只有SQSTM1与DDX10相互作用（图8A）。此外，IFA的结果显示，SQSTM1与DDX10在细胞质中共定位（图8B）。进一步分析了这些货物受体对DDX10表达的影响。有趣的是，SQSTM1、NBR1、TOLLIP和BNIP3L的过表达都促进了DDX10的降解（图S6A）；然而，E蛋白的过表达增强了仅由SQSTM1介导的DDX10的降解，而不是其他货物受体介导的（图S6B）。为了进一步研究E蛋白诱导的DDX10的自噬降解是否是SQSTM1依赖性事件，通过co-IP分析和IFA分析了E蛋白和SQSTM1之间的关系。结果显示，E蛋白与SQSTM1相互作用并共定位（图8C和8D），表明SQSTM1可能参与了E蛋白诱导的DDX10降解。由于SQSTM1主要通过其泛素结合（UBA）结构域识别，因此研究了DDX10是否经历泛素化，然后与SQSTM1相互作用。通过检测在存在或不存在E蛋白的情况下DDX10上多泛素连接的量，发现E蛋白过表达显著增强了DDX10的泛素化水平（图8E），表明E蛋白促进DDX10泛素化，从而被SQSTM1识别。为了进一步测试这一结果，使用了SQSTM1缺陷的HEK-293T细胞（SQSTM1-KO），并且蛋白质印迹结果表明，E蛋白介导的DDX10降解（外源性和内源性）在SQSTM1-缺陷的细胞中几乎完全被阻断（图8F和8G），但在WT细胞中没有，这表明E蛋白诱导的DDX10降解确实是SQSTM1依赖性的。为了进一步研究SQSTM1介导的选择性自噬是否由E蛋白驱动，比较了WT和SQSTM1 KO细胞中E蛋白诱导的自噬水平。蛋白在WT细胞中诱导了可检测的自噬，但在SQSTM1缺陷细胞中没有（图8H和8E），这表明E蛋白通过SQSTM1促进选择性自噬。随后，研究了E蛋白是否可以增强SQSTM1介导的DDX10的降解。与单独过表达E蛋白或SQSTM1相比，E蛋白和SQSTM1的共表达进一步增强了DDX10的降解（图8I）。总之，这些结果表明E蛋白通过促进SQSTM1介导的选择性自噬降解DDX10。

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CONCLUSION

目前的研究表明，DDX10正调节IFNB的产生并诱导ISG的表达，从而抑制PRRSV的增殖。值得注意的是，为了拮抗DDX10的抗病毒活性，PRRSV E蛋白与DDX10相互作用，并促进其从细胞核转移到细胞质，在细胞质中DDX10通过SQSTM1依赖性选择性自噬降解（图9）。这些发现填补了对PRRSV诱导自噬以促进其增殖的机制的理解空白，并为开发抗PRRSV药物提供了对DDX10和PRRSV之间相互作用的新见解。