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医师周刊 | ID:PhysicianWeekly

文章来源：中国卒中杂志，2018，13（8）：853-870

通信作者：倪俊，徐运

脑小血管病（CSVD）是临床常见的一类年龄相关脑血管疾病，由各种因素影响脑内小动脉、微动脉、毛细血管、微静脉和小静脉导致的一系列临床、影像、病理综合征。CSVD可急性起病，表现为脑实质出血或者缺血性卒中；多数则隐匿起病，缓慢发展，临床上通常缺乏特异性表现，患者可出现认知功能下降（血管性痴呆）、平衡步态异常、精神情感改变、尿失禁及生活能力下降等，影像学检查常可发现腔隙病灶、脑白质高信号、脑微出血、近期皮层下小梗死灶及脑萎缩等异常信号。

由于CSVD的病理、发病机制及临床表现均具有异质性，其相关研究进展缓慢，且临床关注度不够，导致老年患者相关致残率高。近年来，CSVD从基础到临床转化研究受到越来越多的关注，包括动物模型、分子生物学、影像识别、临床表现和诊断、治疗及转归，国际CSVD专家组于2013年提出了CSVD影像学诊断标准，国内专家组亦就CSVD达成共识，这些均为CSVD的研究和临床诊疗提供了重要规范和参考。本文将结合目前基础、转化研究和临床需求，组织国内相关领域学者对CSVD的转化医学研究进行撰写，形成共识，希望能给我国从事CSVD研究的基础和临床工作者提供帮助。

1 CSVD动物模型的制备和选择

目前对CSVD病理过程和机制的了解还非常有限，尚缺乏早期预警以及有效的临床治疗手段，因此迫切需要开展更多的基础研究，为CSVD的治疗提供新的理论依据和研究靶点。为了使CSVD的基础研究更加规范，进一步促进研究成果的转化应用，我们归纳了现有主要CSVD动物模型的特征，供同行参考。

1.1 主要CSVD动物模型的制备和神经血管病理表现

1.1.1 双侧颈总动脉结扎模型

1.1.1.1 制备方法 将1%～2%异氟烷麻醉的雄性大、小鼠置仰卧位，使用体温维持仪保持其直肠温度（37±0.5）℃。颈部正中切开，手术显微镜下分离皮下脂肪组织与筋膜，暴露双侧颈总动脉，使用缝线同时结扎双侧颈总动脉，造成大脑的慢性低灌注损伤。手术结束后缝合颈部皮肤切口，将动物放回鼠笼中饲养。两血管结扎模型包括永久性结扎模型或经不同时间后松开缝线进行再灌注模型。也有实验室使用缝线先结扎一侧颈总动脉，1周后再结扎对侧颈总动脉的方法制作该模型。

1.1.1.2 神经血管病理表现 主要包括脑白质和血管损伤、海马神经元缺血性损伤，学习和记忆等行为学测定可检测到认知损害。该模型无CSVD的血管病变特征。

1.1.2 双侧颈总动脉狭窄模型 优缺点同1.1.1模型。

1.1.2.1 制备方法 将1%～2%异氟烷麻醉的雄性C57BL6小鼠置仰卧位，使用体温维持仪保持其直肠温度（37±0.5）℃。颈部正中切开，手术显微镜下暴露双侧颈总动脉，将2个小金属弹簧圈（内径0.16～0.2 mm）分别套在双侧颈总动脉上，通过造成双侧颈总动脉管腔狭窄而引起大脑慢性低灌注损伤。其中直径0.18 mm的弹簧圈最为经典和常用，可造成60%～70%的急性脑血流减少，1～3个月后脑血流减少80%～85%。

1.1.2.2 神经血管病理表现 该模型可引起脑白质血脑屏障通透性的增加（术后3～14 d）、白质损伤（术后14 d）、白质星形胶质细胞和小胶质细胞激活（术后3～14 d）。术后6个月，小鼠出现皮层下微梗死、出血和白质血脑屏障破裂等CSVD特征，伴随记忆功能的显著下降。

1.1.3 双侧颈总动脉渐进性狭窄模型

1.1.3.1 制备方法 将1%～2%异氟烷麻醉的雄性C57BL6小鼠置仰卧位，使用体温维持仪保持其直肠温度（37±0.5）℃。颈部正中切开，手术显微镜下暴露双侧颈总动脉，将缩窄器（ameroid constrictor，内径0.5 mm）套在右侧颈总动脉上，左侧颈总动脉套0.18 mm的小弹簧圈。缩窄器可引起右侧颈总动脉管腔逐渐狭窄，直至28 d完全闭塞。也有实验室将2个缩窄器（内径0.75 mm）分别套在双侧颈总动脉上的报道。

1.1.3.2 神经血管病理表现 该模型可引起脑血流逐渐减少超过28 d，并且右侧脑血流减少更为明显，造成大多数小鼠（81%）右侧皮层下多个脑区的微梗死形成、右侧海马小胶质细胞激活和神经元损失，以及工作记忆功能等认知障碍和运动能力下降。

1.1.4 卒中易感型自发性高血压大鼠模型

1.1.4.1 神经血管病理表现 该模型大鼠在10周前能够自行发展出稳定的动脉高压，5个月时左额叶皮层脑血流减少，9～10个月脑内可出现卒中和出血。可检测到血脑屏障失调、白质损伤、小胶质细胞激活、脑萎缩和神经细胞丢失，以及学习记忆功能严重受损。给予高盐低脂肪饮食可加重早期肾脏和脑损伤导致寿命缩短。

1.1.5 高血压恒河猴模型

1.1.5.1 制备方法 使用直径2 mm的夹子夹住恒河猴的胸主动脉前2～4 cm部位，造成血管狭窄和慢性高血压。也有实验室将该模型应用于大鼠。

1.1.5.2 神经血管病理表现 该模型可造成猴脑内尤其是白质微血栓形成以及认知功能受损，但是不出现CSVD的血管病变特征。

1.1.6 Notch3 转基因小鼠模型

1.1.6.1 神经血管病理表现 通过Notch3基因显性突变引起伴皮质下梗死和脑白质病的常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）模型。该模型小鼠在5个月时表现出脑动脉血管的颗粒状嗜锇物质沉积，12个月时脑内胶质细胞明显增多。可检测到模型小鼠胼胝体、纹状体、内囊和海马部位的白质损伤。模型小鼠在12个月时出现脑血流量下降，但是不出现血脑屏障失调等血管病变特征，行为学改变也未见报道。

1.1.7 颅内内皮素-1注射模型

1.1.7.1 制备方法 将大、小鼠麻醉后固定在立体定位仪上，切开头部正中皮肤，使用Hamilton微量注射器向纹状体或内囊注射血管收缩肽endothelin-1，造成的局部缺血和局限性梗死模型。术后用骨蜡封闭针眼，缝合头部皮肤切口，将动物放回鼠笼中饲养。也有实验室结合endothelin-1和一氧化氮合酶抑制剂注射建立该模型。

1.1.7.2 神经血管病理表现 该模型可造成局部缺血和局限性梗死，引起前肢神经损伤和运动功能下降。

1.1.8 微小栓子血管栓塞模型

1.1.8.1 制备方法 通过颈动脉注射胆固醇晶体或自体微小血栓等栓子来栓塞脑血管的方法建立的大、小鼠模型。大、小鼠经1%～2%异氟烷麻醉，使用体温维持仪保持其直肠温度（37±0.5）℃。暴露并游离一侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，血管夹夹闭颈总动脉、颈内动脉和翼腭动脉，结扎颈外动脉分支及远端后剪断，由剪口处插入内含胆固醇晶体或自体微小血栓等栓子的PE导管，移去血管夹，开放颈总动脉、颈内动脉和翼腭动脉，将栓子注入颈外动脉，通过血流将栓子冲进颅内。术后结扎颈外动脉剪口，缝合颈部皮肤，将动物放回鼠笼中饲养。

1.1.8.2 神经血管病理表现 该模型可引起深皮层、皮层下和海马等多区域的微小梗死、延迟神经细胞死和白质脱髓鞘现象，伴随小胶质细胞激活和胶质细胞增生，以及学习和记忆功能的下降。

1.2 模型选择

研究CSVD白质损伤可选用双侧颈总动脉结扎模型、双侧颈总动脉狭窄模型、双侧颈总动脉渐进性狭窄模型、卒中易感型自发性高血压大鼠模型和微小栓子血管栓塞模型，但是由于双侧颈总动脉结扎模型引起海马神经元缺血性损伤，因此更符合临床慢性脑缺血的病理表现。研究血脑屏障损伤可选用双侧颈总动脉狭窄和渐进性狭窄模型、卒中易感型自发性高血压大鼠模型。研究认知损伤可选用双侧颈总动脉狭窄和渐进性狭窄模型、卒中易感型自发性高血压大鼠模型、高血压恒河猴模型、颅内内皮素-1注射模型、微小栓子血管栓塞模型。研究皮层下或白质梗死可选用6个月双侧颈总动脉狭窄模型、双侧颈总动脉渐进性狭窄模型、高血压恒河猴模型、微小栓子血管栓塞模型。研究CADASIL应选用Notch3转基因小鼠模型。双侧颈总动脉狭窄模型制作容易，重复性好，能够模拟CSVD患者的部分病理特征和认知障碍，因此近年得到广泛认可。双侧颈总动脉渐进性狭窄模型重复性好，能够模拟CSVD患者的部分病理特征和认知障碍，但是费用较高，不太适合研究的广泛应用。微小栓子血管栓塞梗死部位较随意，且该模型操作复杂，但其引起的多发性小梗死更接近CSVD的病理特征。尽管CSVD模型的研究取得了很多进展，但是目前的CSVD模型主要通过慢性低灌注或脑内局部小梗死造成白质损伤以模拟CSVD的某些病理特征，至今没有任何一个动物模型能够全面模仿CSVD患者的全部特征。因此，迫切需要从新的角度探索和开发更接近CSVD患者的动物模型，为CSVD提供新的研究工具。

2 CSVD转化研究的分子技术

研究CSVD的发病机制、早期诊断、预后评估的分子标志物以及治疗靶标的研究均需要分子技术，现介绍一些新的技术。

2.1 全基因组关联研究

全基因组关联研究是指通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记分型，从而寻找与复杂疾病相关的遗传因素的研究方法。现阶段利用全基因组关联研究方法研究小血管病主要集中于寻找与疾病相关的单一标志物，并已发现了多种与小血管病相关的标志物。虽然目前已有针对亚洲人的全基因组关联研究并鉴定出PRKCH 的1425G/A的单核苷酸多样性（SNP）与CSVD相关，然而针对中国人的全基因组关联研究亟待开展。

2.1.1 研究方法

①收集CSVD患者以及相匹配的正常人的样本；②利用SNP阵列对DNA样本进行基因分型；③比较分析得到与CSVD相关的SNP。

2.2 等位基因特异性聚合酶链式反应技术

该技术是一种操作简单、成本低廉且结果准确的SNP检测方法。利用这一方法，可以对目前已经发表的与CSVD相关的SNP在中国人群进行验证，找出与中国人群CSVD相关的SNP。

2.2.1 研究方法

①收集CSVD以及相匹配的正常人的样本；②设计针对特定SNP的特异性引物，并利用聚合酶链式反应对样本进行基因鉴定；③比较患者与正常人样本中SNP差异。

2.3 转基因技术

转基因技术指将特定DNA片段转入特定的生物中。在脑科学领域使用较多的是转基因小鼠。通过将荧光报告基因转入血管相关细胞如血管内皮细胞、平滑肌细胞或周细胞中，可以在CSVD动物模型中研究疾病发生过程中不同细胞在疾病中发生的变化。同样地，也可以在神经元或胶质细胞中引入荧光报告基因，研究在CSVD模型中神经元或胶质细胞发挥的作用。此外，将全基因组关联研究中发现的与CSVD相关的基因如Notch3引入特定的细胞或是从特定的细胞中删除，可以研究特定基因以及信号通路在疾病中发挥的作用，并可以用于筛选药物治疗CSVD。

2.3.1 技术方法

①构建及纯化报告基因或是特定基因的打靶载体；②囊胚注射并移植得到嵌合体动物；③嵌合鼠回交得到子代，鉴定得到目标转基因小鼠。

2.4 染色技术

通过苏木精伊红染色和尼氏染色可以精确地区分梗死组织和正常组织，对脑片进行成像分析可以计算梗死灶大小。通过Fluoro-JadeB组织荧光染色检测神经元退行性变化，原位末端标记组织染色检测神经元的程序性死亡。利用微管相关蛋白-2抗体进行免疫组织化学染色观察神经元突起的损伤状况。

2.5 蛋白和基因表达检测

应用免疫印迹，蛋白质组学方法检测CSVD患者样本与正常人对照样本间表达量发生改变的蛋白质。利用实时定量聚合酶链式反应，原位杂交或是RNA测序的方法检测患者样本与对照样本转录水平发生变化的基因，不仅可以用于探究疾病发生的分子机制，同时也能寻找治疗药物以及评估药物的疗效。

2.6 质谱技术

质谱技术通过测定分子的质量从而进行分子的鉴定。利用这一方法可以高通量地鉴定样本中不同小分子或是蛋白质的组成差异。通过组织匀浆的方法可以研究CSVD患者样本与正常人样本间小分子组成差异，通过单细胞质谱的方法可以研究患者样本不同细胞间分子组成的异质性，通过质谱成像的方法可以研究不同分子在样本中的空间分布情况。

3 CSVD临床转化研究的注意事项

CSVD是一组多病因的疾病，其临床转化研究涉及病因/危险因素、治疗、预后以及预防多方面，研究目的、研究设计需求具有多样性，但总的原则参考中华医学会神经病学分会脑血管病学组发布的《中国急性脑卒中临床研究规范共识2018》，特别是急性期的患者。尽管该共识主要针对在医院住院病房以及门诊进行的卒中急性期治疗和预防相关的临床研究，其提出的临床研究的概念、研究选题和立题、各种研究设计的选择及关键点、临床研究的伦理问题和注册、研究实施与质量控制、研究结果报告应遵循的各项声明，是所有脑血管病包括CSVD临床研究的共性问题。CSVD为脑血管病/卒中的亚型，与大动脉病变（粥样硬化并血栓形成、动脉夹层等）相比较，病因、临床表现以及预后等各有特点，如病程较长、卒中后运动功能障碍程度通常较轻、认知功能障碍损害较为突出等，在对其进行研究设计应有所侧重。

PICOS要素（也称PICOS原则）是临床对照研究设计中的5个不可或缺的关键要素，是Participants（参与者/研究对象），Intervention（干预措施/暴露），Comparison（比较/对照），Outcome（结局/预后）及Study design（研究设计类型）的首字母缩写。关于PICOS原则已有详细的解释和说明，下面就PICOS的各要素在CSVD临床对照研究设计中需要注意的问题进行重点阐述。

3.1 研究对象

CSVD的诊断标准应该使用公认的标准（见共识）。CSVD可以表现为小动脉病变相关的急性卒中（小动脉闭塞型梗死和脑出血），以及慢性缺血性脑血管病头晕、记忆力下降等，亦可以是无症状性的。仅依靠临床症状无法识别CSVD，经典的小卒中（minor stroke）不等同于CSVD，可以是心源性栓塞或大动脉粥样硬化狭窄相关的分水岭梗死或动脉到动脉微栓塞；相反，穿支动脉闭塞导致的内囊梗死可以表现为严重偏瘫。因此，CSVD的诊断依据中影像学检查不可或缺。目前临床上无直接显示CSVD的检查手段，CSVD的影像诊断主要依据头颅磁共振成像（MRI）检查。CSVD的MRI影像特征性表现包括新发皮层下小梗死/腔隙、可能血管源性皮层下白质病变（缺血灶/脱髓鞘）、扩大的血管周围间隙（PVS）、微出血以及脑萎缩。需要注意的是，部分影像学表现不具有特异性，如液体衰减反转恢复序列（FLAIR）序列皮层下白质高信号病变有时难以与多发性硬化、淋巴瘤的白质病变进行鉴别，因此诊断需要排除这些疾病。病因诊断方面，CSVD可以是年龄、高血压、糖尿病等相关的小动脉硬化，亦可以是特定的病因如脑淀粉样血管病、遗传相关的CADASIL/伴皮质下梗死和脑白质病的常染色体隐性遗传性脑动脉病（CARASIL）、自身免疫疾病相关的血管炎，如果研究对象针对特定的病因，需要符合相关的基因、病理诊断标准。总之，CSVD的诊断标准应包括临床表现、影像学检查结果以及必要时的特定病因诊断标准，且需要排除其他疾病，建议依据《中国脑小血管病诊治共识》进行诊断。纳入标准和排除标准应依据具体的研究目的进行定义，同其他临床研究。严格和宽松的纳入/排除标准将影响选择患者的难度以及研究结果的外在真实性（研究结果在临床实践中推广应用范围）。病例来源：除小动脉闭塞/出血的急性卒中患者，多数CSVD患者因临床症状较轻，常就诊于门诊，因此病例登记/筛查应充分重视门诊患者。

3.2 干预措施（或暴露因素）/对照设置

应包括剂量/强度、开始时间、疗程、应用途径以及标准化培训（非药物干预措施），建议参照《中国急性脑卒中临床研究规范共识2018》。

3.3 疗效评价标准

疗效评价标准的定义应包括随访时间、结局指标及其评价方式（是否盲法）和统计分析方法。随访时间主要取决于疾病自然史，包括发病时间与恢复时间。CSVD相关急性卒中的预后评估，随访时间通常于卒中后3个月、6个月或1年，一、二级预防阶段的危险因素/病因控制研究，随访时间通常较长（1年或以上）。结局指标可分为终点指标和中间指标，其定义及其统计分析方法将影响研究样本量的计算，选择结局指标应依据疾病的特点、研究目的以及研究难度（可行性）。在脑小动脉病变的急性卒中干预措施疗效评价研究中，死亡通常不是这类患者的常见或主要结局，应关注残疾水平的评估如改良Rankin量表（mRS）评分，等级漂移分析（ordinal shift analysis）可能更有助于发现治疗组和对照组之间的差异；CSVD缺血和出血事件的风险均较高，因此在评价预防/干预措施疗效的研究中，除了关注缺血性卒中再发外，疗效指标应依据具体研究确定是否纳入颅内出血事件。

3.4 研究设计/方式

与其他疾病研究一致，CSVD临床研究应依据研究目的、可行性（资金/人力）选择具体的研究设计和研究方式，前者包括随机对照试验、非随机对照试验、队列研究、病例对照研究，后者包括临床试验、真实世界研究、卒中登记研究等。关于如何选择研究设计和研究方式建议参照《中国急性脑卒中临床研究规范共识2018》。

未完待续，欢迎持续关注

参与撰写：

朱以诚北京协和医院神经科

刘鸣四川大学华西医院神经内科

张冰南京大学医学院附属鼓楼医院影像科

罗本燕浙江大学附属第一医院神经科

赵冰樵复旦大学医学院

倪俊北京协和医院神经科

徐运南京大学医学院附属鼓楼医院神经科

程忻复旦大学华山医院神经科