花粉管是介导运送植物精细胞至雌配子体并完成受精的关键细胞，对植物的受精和育性以及作物产量具有重要的生物学功能和意义。花粉管的生长是一个高度极性且快速的过程。因此，花粉管也被作为模式植物细胞来研究细胞信号传导、蛋白质极性运输、细胞极性产生与维系、细胞胞吞与胞吐以及细胞骨架空间结构等的生物发生与分子作用机制。但是，调控花粉管极性生长的细胞信号作用网络与分子作用机理都尚未被研究清楚。
华南农业大学生命科学学院王浩课题组整理、优化和发表了如何快速和可靠地运用蛋白质免疫荧光标记方法来研究花粉管中蛋白质的亚细胞定位与分布。其中相关完整详细的实验流程以Immunofluorescence Labeling of Pollen Tubes（ https://bio-protocol.org/e1131）为题整理发表在 Bio-Protocol 杂志，供研究人员参考和应用。整个实验包括2个关键的步骤：花粉管体外萌发和花粉管的固定与免疫荧光标记。从花粉管的萌发到免疫荧光检测完成总共需要2天时间。
免疫荧光标记（Immunofluorescence labeling）是用于研究细胞内蛋白质的亚细胞分布定位与分布的有力工具之一，被广泛地应用于医学和生物学等多领域的研究中。其原理利用了免疫学中抗原和抗体的高度识别结合的特异性反应，并利用荧光标记的二抗来进行信号放大和检测的技术。
研究人员将免疫荧光标记技术（Immunofluorescence labeling）成功应用到生长的花粉管中。首先研究人员总结和优化了百合、烟草、拟南芥这三种常见模式植物花粉管体外萌发条件，以确保获得较高的花粉萌发效率，开展后续实验。随后，对萌发后的花粉进行免疫荧光标记：第一步用戊二醛对花粉管细胞进行固定，其次用果胶酶和纤维素酶对细胞进行通透，并用NABH4对花粉管的自发荧光进行降噪，然后用 B1 Buffer 进行样品封闭。接着依序加入一抗和二抗进行孵育。最后在共聚焦显微镜下观察蛋白质在花粉管内的荧光信号（图1）。
图1. （A）烟草花粉管在体外生长2.5小时候被固定和使用Anti-VSR抗体进行免疫标记。（B）使用Anti-GFP抗体进行对照组标记。标尺为25微米。
免疫荧光标记研究是常用且高效研究蛋白质亚细胞定位的手段，具有广泛的应用场景。读者可以在 Bio-protocol 找到这个方法完整的实验和数据分析流程。
目前，王浩研究课题组致力于研究植物细胞在极性生长和分裂过程中，调控蛋白质极性分泌与胞吐典型与非典型运输途径的分子作用机理和其生物学意义。近年在 Nature Protocols, Plant Cell，Plant Physiology，Plant Journal 和Molecular Plant 等期刊上发表多篇研究论文。课题组的研究受到国家自然科学基金委员会面上项目、广东省自然科学基金和广州市科技研发项目的资助。
参考文献：
【1】Boavida, L. C. and McCormick, S. (2007). TECHNICAL ADVANCE: Temperature as a determinant factor for increased and reproducible in vitro pollen germination in Arabidopsis thaliana. Plant Journal 52(3): 570-582.
【2】Wang, H., Tse, Y. C., Law, A. H., Sun, S. S., Sun, Y. B., Xu, Z. F., Hillmer, S., Robinson, D. G. and Jiang, L. (2010). Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant Journal 61(5): 826-838.
【3】Wang, H. and Jiang, L. (2011). Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protocol 6(4): 419-426.
【4】Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y. and Jiang, L. (2013). Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant Journal 76(3): 367-379.
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