编者按
杂种优势是指杂交后代在生活力、抗逆性、适应性和产量等方面优于双亲的现象。然而，由于遗传分离，杂交种后代会发生性状分离，无法保持其杂种优势。无融合生殖 (Apomixis) 是指不发生雌雄配子核融合而产生种子的一种无性繁殖过程。在无融合生殖植物中，种子的形成没有经历减数分裂过程中的交换，可实现杂种优势的固定。但是，无融合生殖发生机制复杂，常规育种手段难以将其应用于主要农作物育种中，限制了无融合生殖在作物育种中的应用。可贺的是，近期中美科学家在无融合生殖研究领域分别取得了重要突破：一是，美国加州大学戴维斯分校 Venkatesan Sundaresan 教授团队在Nature 发表的水稻无融合生殖体系；二是，中国农科院中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室王克剑团队在 Nature Biotechnology 发表的利用基因编辑技术建立的水稻无融合生殖体系。鉴于该工作的重要意义，我们有幸邀请到袁隆平先生对王克剑团队的工作做了点评，以飨读者！
袁隆平先生点评
杂种优势是自然界普遍存在的一种现象。上个世纪70年代，以发现野生稻败育株为契机，我国首先实现了杂交稻“三系”配套。“三系”杂交稻的培育成功，是水稻育种史上继矮化育种后的又一次重大突破，实现了水稻产量的大幅度提高，为我国粮食增产做出了重大贡献。上个世纪30年代，Navashin等先后提出利用无融合生殖固定杂种优势的设想。
1987年，我在《杂交水稻》杂志上发表了《杂交水稻的育种战略设想》一文，提出了杂交水稻的育种可以分为三系法、两系法和一系法三个战略发展阶段，朝着程序上由繁到简而效率越来越高的方向发展。其中一系法即为通过利用无融合生殖从而固定杂种优势的育种方法。同年，国家启动了高技术研究发展计划（863计划），由我、黎垣庆、蔡得田和赵炳然等共同主持的“水稻无融合生殖的研究”成功入选，由此在国内开始了利用无融合生殖培育一系法杂交水稻探索。但是由于无融合生殖机制的复杂性，一直未能够成功将无融合性状稳定转入到水稻当中。
中国农科院中国水稻研究所的青年研究人员借助精准的基因编辑技术，在籼粳杂交稻春优84中将4个内源基因敲除后，成功使杂交稻产生了无融合生殖性状，产生了与杂交稻一样的克隆种子，而且这个性状可以稳定遗传到下一代。这个工作证明了杂交稻进行无融合生殖的可行性，是无融合生殖研究领域的重大突破，具有重大的理论意义。希望研究人员再接再厉，努力解决还存在的问题，早日将一系法杂交水稻应用到生产。
引自：袁隆平. 杂交水稻的育种战略设想 [J]. 杂交水稻. 1987 (01) 【BioArt注】
论文介绍
杂种优势是指杂交后代在生活力、抗逆性、适应性和产量等方面优于双亲的现象。杂种优势广泛存在于动物和植物当中，对推动农业生产做出了重要贡献。但是由于遗传分离，杂交种子后代会发生性状分离，无法保持其杂种优势，因此育种家必须每年花费大量的人力、物力和财力进行制种工作；同时由于杂交种不能留种，使得农民每年必须购买新的种子。
此外，虽然在多数作物中都存在着明显的杂种优势，但是由于品种间杂交困难导致制种成本过高，限制了杂种优势更广泛地应用，因此目前杂种优势的应用被局限于少数易于杂交制种的作物当中。
无融合生殖是一种通过种子进行无性繁殖的生殖方式，可以随着世代更迭而不改变杂交品种的杂合基因型，使得杂交后代不发生性状分离，从而实现杂种优势的固定【1】。“如果能够使有性生殖作物变为无融合生殖的，那么将可能给农业生产带来量子级的飞跃，随之而来的经济社会效益就可以使原来的‘绿色革命’相形见绌了”【2, 3】。尽管在400多种野生植物中发现了无融合生殖现象，但是通过杂交等常规手段尚未成功将该性状导入到主要农作物中。由于对于农业生产的重要性及其发生机制的复杂性，培育无融合生殖作物被誉为农业研究领域的圣杯【4, 5】。美国和欧洲等发达国家先后投入大量人力和财力，在这一领域展开激烈的竞争【6】。
2019年1月4日， Nature Biotechnology 杂志在线发表了中国农科院中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室王克剑团队题为Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilisation genes 的研究论文（DOI: 10.1038/s41587-018-0003-0 ）。该研究利用基因编辑技术在杂交水稻中同时敲除了4个水稻生殖相关基因，建立了水稻无融合生殖体系，得到了杂交稻的克隆种子，实现了杂合基因型的固定。
研究人员首先进行初步筛选，将籼粳杂交稻品种春优84（浙审稻2013020，吴明国、林建荣等培育）选为水稻无融合生殖研究的模式品种。春优84是利用早花时晚粳不育系春江16A与籼粳中间型广亲和恢复系C84配组育成的粳不籼恢亚种间杂交稻新组合，具有丰富的分子标记和明显的杂种优势，有利于无融合生殖研究时的基因型鉴定和性状观察。
实现无融合生殖必须绕过减数分裂和受精过程直接形成胚并产生种子。减数分裂是动植物在生殖时期发生的一次特殊的细胞分裂过程。在减数分裂时，来自父母本的遗传信息将发生重组，产生染色体数目减半的配子。之前研究表明，参与水稻减数分裂时期的PAIR1、REC8 和OSD1 三个基因同时突变后（此三突材料命名为MiMe，Mitosis instead of Meiosis），植株的减数分裂将转变成类似有丝分裂的过程。首先，该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在春优84中同时敲除PAIR1、REC8 和OSD1 三个基因，快速获得了杂交稻的MiMe 材料。细胞学观察发现，MiMe 植株的雄配子与体细胞一样都为二倍体，但是其植株的表型及育性与野生型相比没有明显差异，其自交后代都为基因型杂合的四倍体，证明通过基因编辑可以使杂交稻绕过减数分裂过程，产生与体细胞基因型一致的克隆配子。
其次，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在春优84中敲除了与玉米单倍体诱导基因同源的MATRILINEAL（MTL）基因，获得杂交稻背景的单倍体诱导材料mtl。mtl在营养生长阶段表现正常，但育性明显下降。在mtl自交后代中成功鉴定到发生遗传重组但基因型纯合的植株, 证明通过基因编辑可以快速在杂交稻的自交后代中诱导单倍体的产生。
最后，通过基因编辑技术在春优84中同时敲除 PAIR1、REC8、OSD1 和 MTL 四个内源基因，获得了可以发生无融合生殖的Fix（Fixation of hybrids）材料。Fix 植株在营养生长阶段表现正常，但育性也明显下降。通过细胞倍性检测，在其子代中获得了细胞倍性为二倍体且基因型与亲本完全一致的植株，这些F2代植株的表型也与其F1代杂交稻高度相似。由此证明，通过基因编辑技术同时编辑四个基因，就可将无融合生殖特性引入到杂交稻当中，从而实现杂合基因型的固定。
利用基因编辑实现杂交种无融合生殖的策略示意图
2018年12月12日，Nature 在线发表了美国加州大学戴维斯分校Venkatesan Sundaresan教授团队题为 A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds 的研究论文，该论文通过编辑 MiMe 三个基因，结合卵细胞中异位表达BBM1（即“减3加1”策略），实现了水稻的无融合生殖。而本研究发现敲除四个内源基因（即“减4”策略）也可以实现杂交水稻的无融合生殖，将来如果结合DNA-Free基因编辑技术，将可以实现无外源成分导入的无融合生殖。由于这两种策略在实现无融合生殖的同时，都对育性有一定程度的影响。未来，将着力于提高无融合生殖的育性，以实现其在水稻生产的应用。另外，在很多蔬菜或饲用作物中，种子不作为收获对象，因此该策略有望最先应用于这些作物当中。
王克剑研究员（左）、王春副研究员（右）
王春副研究员为该论文的第一作者，王克剑研究员为通讯作者。法国国家农业研究所Raphael Mercier教授、中科院遗传与发育生物学研究所程祝宽研究组参与了该研究及论文的撰写工作；中国水稻研究所吴明国课题组为本实验提供了杂交稻及其亲本材料。该研究得到中国农科院创新工程及国家自然科学基金经费资助。
值得一提的是，经沟通，该论文于2018年6月初与美国加州大学戴维斯分校 Venkatesan Sundaresan教授团队同步投稿 Nature 杂志。评审专家认为“这是农业种业生产和作物育种上的一次重要技术突破 (Without doubt the data presented represent a real technical breakthrough for agricultural seed production and plant breeding)”。该论文经过二轮评审后转投至Nature Biotechnology杂志，并于2018年12月11日被正式接收。12月12日，Nature杂志在线发表了Venkatesan Sundaresan教授团队的工作。12月13日，在Nature Biotechnology 杂志的授权下，作者将6月份同步投稿时的最初文稿投放至预印本平台bioRxiv上。Nature Biotechnology 第一时间在其官方推特平台以Two groups develop methods to produce clonal seeds from hybrid rice 的评论对两篇文章进行了同步推送。
致谢
特别感谢中国水稻研究所钱前研究员对本文的支持，尤其是对点评工作的支持和帮助。
参考文献
1. 孙宗修，程式华. 杂交水稻育种——从三系、两系到一系. 中国农业科技出版社. 1994年
2. Calzada, J.P.V., Crane, C.F. & Stelly, D.M. Apomixis: The Asexual Revolution. Science 274, 1322-1323 (1996).
3. van Dijk, P. & van Damme, J. Apomixis technology and the paradox of sex. Trends in plant science 5, 81-84 (2000).
4. Sailer, C., Schmid, B. & Grossniklaus, U. Apomixis Allows the Transgenerational Fixation of Phenotypes in Hybrid Plants. Current biology : CB 26, 331-337 (2016).
5. Khanday, I., Skinner, D., Yang, B., Mercier, R. & Sundaresan, V. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds. Nature (2018).
6. 蔡得田, 陈冬玲. 水稻无融合生殖的研究动态及其进展. 华中农业大学学报, 529-534 (1993).
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