来源：园艺研究（ID: hortres）
本文为《园艺研究》作者分享会【园艺作物转录因子】的文字整理版，本次作者分享会邀请了中国农业大学的傅达奇副教授，高颖博士，范中奇博士与作者交流群中2400多人进行了热烈的交流讨论。
1.您好，请问比较两种植物的抗性的话，如果A植物中与抗性相关的转录因子比如myb表达量和表达数目在胁迫过程中上调或变多的幅度大，是不是说明它更有耐性。然后结合生理指标作出说明就可以了？
答：总的来说，研究植物抗性一般以植株的抗逆表型作为主要参考，基因的表达量可以作为辅助说明。比如通过表型说明a植物比b植物在更强的抗性胁迫条件下存活，或者说明在同一胁迫条件下a比b长势好。基因表达量在胁迫过程中上调并不能直接说明问题，例如同样是受到叶片衰老和植物激素ABA诱导的NAC转录因子，超表达RD26或ORE1则加速叶片衰老而超表达JUB1则抑制叶片衰老。另外，研究某一基因的具体功能，最好的就是通过转基因途径，例如把MYB超表达后、或者同源突变后，观察抗性基因的表型，才能最准确的确定该MYB在胁迫过程中是正还是负调控因子。
2. 老师您好，请问目前果树研究中比较适合western blot和ChIP实验的标签有哪些，您一般选择怎样的标签？谢谢老师。
答：关于标签的选择不能一概而论，最好通过预实验来选择合适的标签，因为在不同的物种甚至是把标签连到目的蛋白的N端和C端都可能会出现不同的情况。我们会在构建基因表达载体时同时构建多种不同标签以及把标签分别连到目的蛋白的N端和C端，在本氏烟草中进行瞬时表达来筛选出适合的标签，但这也只能作为参考，因为在不同植物中因为蛋白质高级结构不同也可能存在标签在烟草中裸露但在其他物种中却被包裹而检测不到的情况。
3.（1）.反向遗传学中，如何确定一个基因属于转录因子？（2）.如何确定转录因子的功能？（3）.转录因子的功能和其基因表达量的关系？
答：（1）首先可以在植物转录因子数据库（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）中查找你的目的基因或者在NCBI中通过序列比对，初步确定其所属的转录因子家族，然后通过氨基酸序列比对以及蛋白质结构预测等方法确定其是否含有该转录因子家族特有的结构域。（2）首先可以经过系统进化分析或者查找文献寻找已经报道的同源基因，根据同源基因的功能进行预测，其次可以通过VIGS技术或者CRISPR技术将该基因瞬时沉默或编辑来观察植物的表型。（3）基因在植物不同组织以及植物生长发育的不同时期的表达情况对预测基因的功能具有一定的参考价值，但基因的功能和表达量之间并没有绝对的关系。
4. 老师您好，我是做枣果实ERF转录因子调控成熟机制方向的。想请教您，枣是非跃变果实，由于转基因体系不成熟，我打算在番茄上进行过表达研究其功能机制，但是和别人讨论的时候，有人说番茄是跃变的，那我在番茄上验证其对于乙烯合成调控方面的功能，合适吗？得到的分子网络似乎也难以解释枣的调控吧？另外，打算用转基因果实chipseq来鉴别下游靶基因和结合位点，请问我做完相关实验，应该还进行哪些验证工作呢？具体用什么技术会好些？
答：跃变型和非跃变型果实的主要区别就是乙烯是不是果实成熟的必要条件，以跃变型果实为实验材料来研究非跃变型果实中乙烯调控相关基因的功能是不合适的。你可以查阅相关文献看看是否可以用非跃变型果实草莓作为材料，草莓的转基因体系已经非常成熟了。具体可以参考中国农业大学李冰冰教授团队的相关文献，如：CRISPR/Cas9-introduced single and multiple mutagenesis in strawberry。另外关于转录因子下游靶基因的验证可使用凝胶阻滞分析（EMSA）以及双荧光素酶瞬时表达（DLR）实验等都可以作为对ChIP-Seq结果的进行进一步验证。
5. 老师好，最近在做重金属镉对园艺作物的胁迫相关研究（10 mg/L, 15 d, 30d）,做了与对照组的转录组研究，得到CK vs 15d,CK vs 30d的转录组数据，我通过绘制韦恩图找到两组数据上调和下调的共表达基因，这些共表达基因应该是该作物响应镉胁迫的相关基因，再试图通过nr-annotion，GO，KEGG等找到相应的抗镉胁迫的通路相关的转录因子，再选取典型的相关基因进行qPCR验证。问题1：我这个分析思路对吗？问题2：植物响应镉胁迫的经典转录因子有哪些，应该关注哪些通路？问题3：形成螯和肽是植物耐镉的重要机制，以谷胱甘肽为合成前提，我如果着重在这条路径上寻找和分析相关转录因子，是否有意义？问题4：找到相关转录因子，验证其功能是不是都是一般文献套路，通过亚细胞定位，互作蛋白，转基因验证等？
答：（1）思路是可行的。（2）和（3）关于植物响应镉胁迫我们没有研究过，需要你自己多查询相关文献加以了解。（4）对于预测相关的转录因子首先可以对转录因子的定位、表达模式等基本信息进行分析，然后可以通过VIGS或者转基因技术获得基因沉默或者超表达的植株，进行镉胁迫处理，观察是否具有预期的表型。在有表型的前提下，可以进一步寻找靶基因以及互作蛋白。
6. 请问番茄中有两条等位基因，在通过PCR扩增检验被编辑片段时如何区分两种模板?另外在研究基因编辑过后的植株表型等指标时，以野生型为对照还是以农杆菌转化成功但未造成编辑的再生植株作为对照呢？如何排除农杆菌插入不同位置造成的影响?
答：（1）通过PCR扩增检测靶点片段时不会区分两条等位基因模板，所以PCR产物测序结果会同时反应目的基因在两个等位基因中被编辑的情况。等位基因1和2均未被编辑，定义为野生型（Wild-type）；等位基因1和2仅有1个被编辑，定义为杂合体（Heterozygous）；等位基因1和2均被编辑，且编辑方式相同，定义为纯合体（Homozygous）；等位基因1和2均被编辑，但编辑方式不同，定义为双等位突变（Biallelic）；编辑方式达到三种及以上，定义为嵌合体（Chimeric）。（2）你说的两种对照方式都是可以的，我们一般以野生型作为对照。（3）我们可以通过多代培养筛选出Cas9-free的株系，比如在T0代，sgRNA表达盒只插入了等位基因1，但你的目的基因在等位基因2发生了编辑，那么在T1代时，通过等位基因的分离和自由组合，我们就可以获得有两条等位基因2的纯合株系，在这个株系中已经不存在Cas9蛋白，该基因编辑突变体也就和自然突变体无异。
7. 傅老师您好，我验证转录因子和启动子互作的时候，做emsa实验，结果阻滞条带一直是两条，请问这是正常现象吗？为什么一个蛋白质会出现两条滞后条带，谢谢。
答：阻滞条带是两条是正常的，有许多文献的EMSA图片中也会有出现。出现滞后条带的原因有两种：1是在细菌中表达目的蛋白的时候，转录过程中可能中途遇到其他问题如RNA聚合酶脱落等，导致基因表达的不是特别完整，但mRNA也能正常翻译蛋白，这样的蛋白会稍微短一点，由此就形成了两种类型的蛋白。2也有可能是菌中有其他蛋白对目的蛋白存在干扰。这两种原因都有可能导致纯化后的蛋白不是特别单一。总的来说，只要EMSA反应中有结合带，且目标结合带能被冷探针竞争下来，由此证明转录因子蛋白与下游靶基因启动子上的结合位点是特异性结合的就能说明问题。
8. 老师你好我是分子小白，我最近在两份材料(处理和对照)的转录组数据中发现了F-BOX存在差异，我又预测了一下它的启动子，发现与两种激素有关，然后我想找与这两种启动子有关的转录因子，不知道如何下手，想研究这个Fbox上游启动和下游靶基因，不知道采用什么方法，也不清楚我这个思路正确否，请老师指点一二，谢谢！
答： F-box蛋白主要是通过形成SCF复合体参与泛素介导蛋白降解途径行使生物学功能。从目前的研究来看，F-box都有报道直接或间接的参与了ABA、ET、SA和JA等植物激素的信号转导。寻找F-box相关的转录因子，可通过酵母筛库筛选到与F-box存在互作的转录因子，或通过你已测定转录组找到与F-box变化相关的转录因子检测是否互作。F-box作为E3酶，转录因子通常作为底物来被E3酶泛素化降解。因此预测F-box的上下游基因可通过与之互作的转录因子作为枢纽，通过寻找转录因子对靶基因的结合位点来寻找到共同调控的下游靶基因。
9. 老师好，我想请教一下，在没有基因组的情况下，想验证已知的MYB家族转录因子和已知次生代谢合成基因FLS的互作关系，但FLS的启动子区域位置，想知道是否除了染色体步移，没有其他更好的方法获的启动子区域了？
答：在未知基因组的情况下，染色体步移法确实是得到启动子序列的唯一方法。
10. 请问烟草花叶病毒感染会引起植物果实花青素的完全缺失吗？请问转录因子的表达量会和自己预测的完全相反吗？
答：（1）我们对烟草花叶病毒也没有深入研究，首先要查阅文献确定你所说的植物是不是TMV的寄主，只有TMV的寄主才能被TMV侵染，其次要确定TMV是否会引起果实出现病毒感染症状。（2）转录因子的表达量确实不能直接说明转录因子的功能。但转录因子有众多家族，不同家族中不同基因属于不同亚族，它们所行使的功能也可能完全不同，因此预测转录因子的表达量还有诸多考虑因素。除此之外，即使相同表达水平的转录因子所具有的功能也会完全不同。如NAC家族中的，同样受到叶片衰老诱导、在衰老过程中表达趋势相似的转录因子RD26、ORE1和JUB1，RD26或ORE1对拟南芥叶片衰老就具有正调控功能，而JUB1则有负调控功能，超表达JUB1使叶片衰老得到延缓。
11. 不做酵母单杂、双杂筛库的试验，想要研究某一物质的调控，如何能快捷准确的找到调控这个物质的转录因子呢？
答：寻找某一基因是否受到转录因子调控，首先分析该基因启动子区域是否有转录因子的结合元件。同一基因的启动子区域可能存在多个转录因子的结合位点。所以我们通常所研究的下游基因也并不是受到单一的某个或某类转录因子的调控，而有可能是受到多个转录因子的共同调控。可从探究某一通路着手，逐渐扩展到调控网路的解析。
12. 蛋白如何预测磷酸化位点，还有怎么知道蛋白会不会泛素化？
答：（1）蛋白磷酸化位点的预测主要有两种方法。首先通过生物信息学的方法对目的蛋白进行的磷酸化修饰位点进行预测，进一步利用免疫沉淀和质谱技术对其进行具体实验验证。常用的磷酸化位点的预测网站有phosphosite、phosphorylation site database、SEISS-PROT等。高效液相色谱和质谱技术检测可以分辨出蛋白质修饰前和修饰后分子量上的变化，由此检测出目的蛋白翻译后修饰前后的分子量的精确变化。（2）检测某一蛋白是否会发生泛素化，可以通过质谱检测及氨基酸比对是否与已经报道的发生泛素化的基因有较高相似性，再进一步通过使用泛素化抗体进行western blot实验验证，检测该蛋白是否能被泛素酶降解。
13. 老师你好，我是做茶树色彩变化的，选择了黄色茶树品种适度遮阴30天后，黄化茶树变绿了，取黄色、绿色茶树样品进行转录组测序，得到了转录组数据，我通过绘制韦恩图找到两组数据上调和下调的共表达基因，后面应该怎么做，有推荐吗？
答：重点应关注差异基因而非表达趋势相似的基因，来分析两种茶叶颜色为何不同，及其受到是否受到相关转录因子调控。还有你的实验目的是什么很重要，是关注颜色怎么变化，还是其他。
您的实验只有一组处理，一组对照，所以不需要做韦恩图，您应该把上调基因和下调基因放在一起来进行研究，从显著上调和下调的基因中找到您感兴趣的基因进行新一步研究。
14. 我想咨询下，验证转录因子间互作有哪些快速的检验方法？
答：可以通过酵母双杂交、CoIP、CoIP-MS、分裂荧光素酶互补实验、BIFC等试验进行蛋白互作分析。
15. 直接检测的TF蛋白抗体是订购吗？有没有更直接途径可以检测啊？
答如果是标签抗体就直接购买，如果是植物自生内源蛋白的抗体，就需要表达或者合成蛋白，免疫获得抗体。
16. 在做果疏类材料的Western时，我发现同样的标签好像没有拟南芥材料好检测，是不是因为果蔬类材料（比如叶片）次生代谢产物较多不利于检测，请问一下老师有没有做过番茄转基因材料或者苹果转基因材料的western实验，具体用的方法有可以参考的吗？
答：叶片的总蛋白还是比较好提取的，果实中总蛋白的提取确实相对比较困难。总蛋白的提取可以参考文献：A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis。另外可以尝试调整蛋白的上样量、一抗的浓度、二抗的浓度等参数来优化实验。
17. 问题1：VIGS沉默基因是仅限于注射的叶片以及该叶片上部的基因沉默，还是该植株整株上（包括根部）都能把该基因沉默？问题2：有没有办法像VIGS那样把根部的基因瞬时沉默掉（像VIGS那样效率很快）？
答：问题1，病毒在植物体内可以运动，运动到哪里，就能沉默到哪里，前提是这个病毒能侵染目标植物，但是有些病毒不能侵入种子和生长点。问题2：可以采用芽侵染，播种到土里，就可以影响到根。参考文献：Sprout vacuum-infiltration: a simple and efficient agroinoculation method for virus-induced gene silencing in diverse solanaceous species.
Yan HX, Fu DQ, Zhu BZ, Liu HP, Shen XY, Luo YB.
Plant Cell Rep. 2012 Sep;31(9):1713-22. doi: 10.1007/s00299-012-1285-1. Epub 2012 Jun 21.
18. 老师您好，请问解析甘蓝低温花青素积累基因，转录组测序样品处理怎样设置更合理呢？
答：首先确定最适合的低温温度。例如5度为获得最佳效果的温度设为实验组温度，常温22度为对照组温度。设置实验组和对照组，可在不同储藏天数下取样后送测序。另送转录组测序时，一般每个处理组都应该设置3个生物学重复，拿到结果后，重点关注实验组和对照中关于花青素通路上的相关基因是否存在差异。
19. 老师好，我是做不同繁殖方式下枣果实转录组和代谢组差异的，请问转录组中的差异表达基因编号没有在已知的参考基因组中找到基因名称，该如何找到基因的家族和功能等信息，对应到具体的代谢通路上，进而进行相关联分析呢？
答：建议在转录组分析过程中应尽量找已知功能的基因进行研究，因为未知基因的功能本身就不确定，很难进行进一步研究。可以在植物转录因子数据库（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）中查找你的目的基因或者在NCBI中通过序列比对，初步确定其所属的转录因子家族，然后通过氨基酸序列比对以及蛋白质结构预测等方法确定其是否含有该转录因子家族特有的结构域。另外可以经过系统进化分析或者查找文献寻找已经报道的同源基因，根据同源基因的功能进行预测。
20. 请问同属不同种的植物之间可以做转录组，蛋白组，代谢组的比较吗？
回答：很少这样做的。性状有差异的不同品种还可以。实验目的是什么？为什么要做同属不同种的比较。
21. H2O2如何激活myb转录因子？有没有可能是通过H2O2信号通路的靶蛋白与myb互作激活的？
答：过氧化氢会作为信号分子，也许会通过蛋白激酶去影响MYB转录因子的调控能力。具体情况具体分析。
22. 你好老师，我想问一下转录组数据预测到的转录因子怎么整合到具体通路上？就是说这些预测的转录因子哪些是与我所关注的通路有关？谢谢。
答：可以通过查阅相关文献了解您想要研究的通路中起调控作用的最关键的转录因子有哪些，然后在转录组数据中进行筛选。
23. 老师，你好，我想问一下已经知道myb有很多作用，但是要在一个物种的特异部位做研究，这个部位没有人研究过，该怎么着手啊？我是在转录组里筛选myb，通过荧光定量筛选其中上调的，但是筛选出来的基因不确定是不是我所需要的，那需要怎么继续？
答：首先对你感兴趣的转录因子进行初步的分析，如通过系统进化分析、同源比对等方式找到其同源基因，通过已知的同源基因的功能对你感兴趣的转录因子的功能进行预测。
24. 老师，您好！我们做了一组转录因子的瞬时过表达，发现代谢产物是提高的，做了表达谱，得到的差异基因中，发现该代谢产物的合酶基因是下调的，这种情况该怎么解释？是本身的生物学问题？还是测序质量问题？还是样品问题？
答：需要多重复几次，包括代谢产物测定以及相应的RNA-seq测序，而且建议这两个试验用同一批次样品。因为代谢和转录受环境条件影响较大。你说的那些原因都有可能。
25. 老师您好，请问在确定转录因子的启动子的时候，如果上游2k正好处于前一个基因的外显子上，这个时候考虑启动子是考虑其自身前2k的启动子还是上游2k所位于的这个基因的启动子
答：一般考虑自身前1k-2k位置即可
追加：取A基因CDS上游2K做启动子分析，发现这2K已经包含了上游B基因的外显子，所以直接截取到临近上游B基因的序列做启动子分析，这样对吗？
答：通常我们会避免接触到B基因的序列，在分析转录因子和下游靶基因的结合时，主要只调取下游靶基因ATG前1000bp左右的序列，在分析其结合元件即可。
追加：请问您关于启动子元件预测的网站的问题，您比较推荐哪个网站，常用的plantcare预测出来元件比较少，PLACE预测出来又相对来说匹配性不是很高，会出来很多元件，所以想请问一下您平时采用的预测网站或途径，再次感谢您的解答~！
答：最直观的途径还是通过文献来找到结合元件。预期会有一类转录因子重点关注，例如想找寻某个下游靶基因的启动子是否会受到WRKY转录因子的调控，那么就到这个基因的启动子序列上去一一查找是否存在w-box结合元件。
追加：傅老师您好，想请问您如果转录因子的酵母自激活实验显示其没有自激活活性，这种情况对转录因子来说是否正常，谢谢老师~！
回答：该情况正常，转录因子自身并不是都具有转录激活活性。关于转录因子自身的活性分析，除在酵母体内实验外，还可以在烟草体内进行转录活性分析。通常来说，在酵母体内没有自激活活性的基因在烟草体内的双荧光素酶实验可能会表明该转录因子具有转录抑制活性。
26. 傅老师，您好！请问做BIFC效果比较好的有哪些载体？
答：BiFC的载体是YNE和YCE，通常会接到不同骨架上，我们实验室现在所用的有PEAQ骨架和PSP骨架。
27. 老师，您好！我想问下，超表达和突变回补技术，是否就可以对转录因子进行验证了？RNAi在验证中是否还要做吗？
答：这些技术可以验证转录因子，RNAi应该也要做，但是现在基因编辑会更好。关键不是所有基因都有突变体。
28. 老师您好，我有几个问题想请教您，问题1：请问如何找到一个转录因子的下游呢？通过TFDB预测靠谱吗？问题2：TFDB预测会出现好多下游，通过拟南芥中同源基因预测的下游中有和我研究性状相关的基因，但是通过所研究物种基因预测的下游中没有研究性状相关的基因，这种情况下可以参考拟南芥同源基因预测的结果吗？问题3：拟南芥中报道的过表达一种转录因子表现出我关注的性状，家族成员也有冗余作用，我可以通过比对将本物种中同源基因在所研究物种中过表达来研究这个转录因子的功能吗？获得过表达植株后还可以进行哪些研究呢？
答：1.转录因子广泛参与植物的生长发育过程，因此需要明确你关注到的是哪一个调控过程中下游基因。再通过寻找某一个下游基因的启动子序列上是否含有目标转录因子的结合元件。2.可以参考模式植物基因的预测结果。3.可以在同源物种中过表达后研究。获得超表达植株后主要观察其是否有你所关注的性状出现，并通过一些生理指标测定来进一步说明，其次可以用RT-qPCR检测超表达植株中与野生型植株相比，相关基因是否发生变化，甚至将超表达植株与野生型植株送转录组测序，进一步寻找一些差异基因。
29. 老师可以解释下VIGS 和CRISPR的区别吗？
答：VIGS是病毒诱导基因沉默，属于RNAi, DNA不受影响。CRISPR是基因编辑，发生在基因组水平的缺失和插入。
30. 傅老师您好，请问转录因子的结合位点能不能用ChIP-seq的方法得到，并且如何从ChIP-seq的结果中得到比较准确的结合位点，有没有比较好的参考文献推荐？
答：转录因子的结合位点可以通过ChIP-seq预测，具体可以关注香港中文大学钟思林老师团队的文献。
31. 植物的基因相似性达到多少可以认为是同源基因？
答：大约60%。
32. 老师，您好！请问做DLR的时候用本氏烟效果怎么样？一般注射几天后取样进行测试？
答：在本氏烟草中实验可以免去在原生质体中提高浓度质粒的麻烦，效果也很好。通常在注射48-72h后检测。
33. 转录因子能否与功能基因直接互作？
答：可以通过分析该功能基因的启动子区域，确定该启动子区域是否含有您要研究的转录因子的结合位点，如果存在转录因子的识别位点，那该功能基因可能是该转录因子的靶基因。如果您的意思是蛋白互作的话也是可能的，可以通过酵母双杂交、BIFC、分裂荧光素酶互补实验、CoIP等实验进行验证。
34. 傅老师，您好！我们在做CoIP验证蛋白互作，首先在目的蛋白的N端分别加上MYC和FLG标签，转化农杆菌后瞬时侵扰烟草，侵染3天后，提取侵染烟草叶片总蛋白做WB，但是只检测到标签，而没有重组蛋白，是提取总蛋白时标签断裂吗？还是因为目的蛋白表达量少？怎么能避免这些问题？
答：一般瞬时表达两天就可以提取总蛋白进行进一步检测了。可以尝试不同的标签或者将标签加在C端。
35. 傅老师您好，采用takara的PGADT7/PGBKT7的酵母双杂系统时，检测转录因子的自激活，如果这个转录因子没有自激活，是不是说明这个转录因子对下游基因的调控是起到负调控的作用？或者是这个转录因子没有转录调控作用？
答：只能说可能是转录抑制其靶基因，需要进一步实验分析；至于有没有转录调控作用，也不能太绝对，得实验验证。
36. 老师您好，请问前期生理实验做出来不同处理下有机酸的含量有显著差异，在代谢通路中，如何可以准确全面地找到影响有机酸合成中造成差异基因表达的代谢物、酶或代谢路径？
答：测序获得差异表达基因，再可以尝试通过KEGG PATHWAY Database（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）查找。把差异基因和代谢通路关联。
37. 酵母单杂和EMSA实验都做出了转录因子和启动子的互作，但是双荧光素酶实验做出来的结果并不稳定，请问这种情况下是否能够确定转录因子和启动子互作的？双荧光素酶实验是否和烟草叶片的老幼和叶片生长状态有关？
答：EMSA实验是体外验证转录因子能够绑定下游基因启动子的的直接证据。酵母单杂和烟草体内的双荧光素酶实验是体内验证，双荧光素酶实验优点是可以直观的反映转录因子对下游基因启动子的转录作用是激活的还是抑制的，建议还是在重复双荧光素酶实验。另外还可以通过chip-qPCR实验进行进一步的验证。烟草体内的双荧光素酶实验确实受到烟草生长状态的影响，所以在同一次实验时，一定要选取长势大小、生长状况相似的烟草进行实验。
38. 老师您好，有几个问题请教：请问一般什么样的ERF会被乙烯诱导？有ERF调控myb或者NAC的研究么？还有就是您认为这三类转录因子的功能在不同植物中保守性如何？
答：可以通过用乙烯处理之后检测ERF表达量的方法来了解响应乙烯的ERF。ERF对MYB和NAC的调控作用可以查阅相关文献加以了解。转录因子在不同植物中的功能可以通过已有的报道进行参考，但是具体的功能还要在具体的植物中研究。
39. 傅老师，请问用F-box蛋白筛选酵母文库，想找到与F-box互作的底物蛋白，筛库时长出来的斑点特别少，是否因为在互作的同时，底物蛋白立刻发生了泛素化降解?怎么样可以控制底物的降解，或者有没有其它方法或系统可以排除降解的问题，筛选到F-box的互作蛋白?(与F-box同时做的其它蛋白筛选可以长出很多斑，可以排除酵母文库系统的问题。)
答：筛库的结果主要考虑长出斑点的测序结果，是否能找到关键的互作基因。在酵母体内互作的同时发生泛素化的可能性很小，要考虑酵母体内是否存在E1和E2酶来共同发生泛素化降解。
40. 傅老师，您好！植物chilling和freezing处理有什么区别，两者之间的响应机制是一样的吗？
答：一个是冷害，一个是冻害，冷害是一种生理反应，冻害会造成细胞膜物理结构破坏。
41. 傅老师您好，我是生物信息学方向，我之前没有接触过转录因子预测分析，没有这方面的经验，您可以推荐一些预测植物转录因子较为准确的软件或者网站么？
答：可以参考http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/
42. 老师您好，我在用Y1H系统做酵母单杂的时候，转了线性化的启动子，但是AbA无法抑制住是什么原因呢？启动子片段300bp左右。AbA已经上1000了。有没有转录因子特异调控果实硬度的呢？
答：该段启动子不适合Y1H实验体系，比如启动子上某些元件可能导致其在酵母中活性太强 aba压制不住。建议换一段启动子序列试试。有通过调控细胞壁代谢来影响番茄硬度的转录因子，但不能说他是特异性的，还可能同时调控其他代谢途径，只是没有被关注到而已。
43. 老师，您好！我是做苜蓿干旱胁迫！转录组我们有三个处理，空白对照，胁迫和复水！为什么在复水vs 胁迫这个处理中，差异基因特别少，并且Go富集通路和KEgg富集通路都特别少？而且在这个组合中NADPH抗氧化酶这个基因还是下调？感觉和我测得生理指标不一致，我测得抗氧化酶活性胁迫后增加，复水又下降！还有就是显著富集的通路里面包括TCA和糖酵解，如何利用这两个通路和抗旱以及我测量的生理结合再一起？
答：多少不是关键，关键是能不能找到干旱胁迫相关的差异基因。GO和KEGG分析都只是辅助手段，关键还是要分析差异表达基因。差异基因的表达除转录组预测外，还需要进一步的荧光定量实验验证，再确定编辑NADPH抗氧化酶的基因可能不止有一个。另外差异基因的表达量和最终的酶活性可能并不是正相关的。可进一步寻找受干旱诱导的转录因子是否能够再调控与TCA和糖降解的相关基因。以转录因子为关键点来结合这两个通路。
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