近年来，CRISPR-Cas9核酸酶被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制工作中。但野生型SpCas9核酸酶介导的序列特异DNA剪切需要识别5’-NGG-3’ PAM位点，使得SpCas9核酸酶在目标基因组中的有效编辑区间受到明显限制。同时，SpCas9基因组编辑系统存在潜在的非特异剪切活性（通常所说的“脱靶”），会对编辑对象产生不确定的生物学效应。鉴于此，如何有效拓展SpCas9核酸酶PAM位点设计区间，并进一步提升其DNA剪切特异性，是SpCas9核酸酶这一基因组编辑有效工具更为广泛应用的关键所在。

近日，电子科技大学生命科学与技术学院/信息生物学特色研究中心张勇教授课题组在国际植物科学顶级期刊Molecular Plant上发表了题为Improving plant genome editing with high-fidelity xCas9 and non-canonical PAM-targeting Cas9-NG的研究论文。该研究工作针对近期在哺乳动物及人源细胞系中报道的5’-NG-3’ PAM位点识别的SpCas9变异体xCas9（Hu et al., 2018, Nature）、 Cas9-NG（Nishimasu et al., 2018, Science），构建了多元化植物SpCas9基因组编辑系统，以水稻为模式材料，系统评价了5’-NG-3’ PAM位点识别SpCas9变异体在植物基因组编辑工作中应用的可行性、有效性及适用性，对植物版xCas9、Cas9-NG（Cas9-NGv1）核酸酶基因组编辑特性进行了深入解读，进一步拓展了植物基因组编辑工具箱。

研究者先后发展了多个版本的高特异性SpCas9变异体编辑工具，但在提升SpCas9介导的DNA剪切特异性同时，其剪切活性均有明显下降。与之对应，研究者也同步发展了非5’-NGG-3’ PAM位点识别的SpCas9变异体编辑工具，但识别的PAM位点多为4碱基基元，甚至更为复杂。直到2018年，研究者基于“噬菌体介导的连续进化”（phage-assisted continuous evolution）、“理性设计”（rationally engineering）策略，分别构建了可识别5’-NG-3’（及其他非5’-NGG-3’）PAM位点的xCas9（Hu et al., 2018, Nature）及 Cas9-NG（Nishimasu et al., 2018, Science）基因组编辑工具。对比野生型SpCas9核酸酶，研究结果表明：1）xCas9可以特异性识别5’-NG-3’、5’-GAA-3’、5’-GAT-3’ PAM位点，介导哺乳动物及人源细胞系基因组内源位点有效编辑，同时其DNA序列剪切特异性也得到有效提升（Hu et al., 2018, Nature）；2）Cas9-NG可以特异性识别5’-NG-3’ PAM位点，并在人源细胞系中表现了优于xCas9的基因组编辑活性（Nishimasu et al., 2018, Science）。

近期的工作中，研究者先后报道了Cas9-NG v1（Cas9-NG变异体的基础版本）（Endo et al., 2019, Nature Plants）、xCas9（Wang et al., 2019, Plant Biotechnology Journal）在水稻基因组中5’-NG-3’ PAM位点的编辑结果。前者研究中，使用了Cas9-NG核酸酶变异体的基础版本（Cas9-NG v1），并没有对比评价Cas9-NG介导的植物基因组编辑结果；后者研究中，xCas9不但没有明确显示基于5’-NG-3’ PAM位点的编辑活性，而其基于5’-NGG-3’经典PAM位点的编辑活性也明显下降。同时，两项研究工作中，都仅对有限的水稻基因组位点进行了编辑活性评价，对应SpCas9变异体在植物基因组编辑中的活性、效率、特性均有待进一步明确。

在充分借鉴前期相关工作实验设计、实施策略、研究结果的基础上，电子科技大学张勇实验室及马里兰大学Yiping Qi实验室，以水稻为模型，结合原生质体瞬时编辑特性通量分析及稳定转化编辑事件具体评价策略， 对xCas9、Cas9-NG核酸酶变异体在植物基因组编辑中的可行性、有效性及适用性进行了充分评价，为植物基因组编辑工作提供了多元化xCas9、Cas9-NG编辑系统。具体研究工作简述如下：

1、水稻原生质体瞬时表达+扩增子NGS分析结果表明：1）所有16种5’-NGN-3’ PAM位点中，xCas9的编辑活性主要集中在经典的5’-NGG-3’ PAM位点，而排除5’-NGG-3’的5’-NGN-3’ PAM位点中，xCas9介导的NHEJ编辑活性十分有限，仅5’-CGA-3’、5’-CGC-3’、5’-GGA-3’、5’-GGC-3’、5’-TGC-3’ PAM位点显示了>10.0%的NHEJ编辑活性（Figure 1A）；2）向导RNA单碱基错配编辑活性分析中，xCas9在5’-NGG-3’ PAM位点保持了与野生型SpCas9相当的编辑活性，同时其编辑特异性在主要错配位点处均明显高于野生型SpCas9（Figure 1B）；3）通过与rAPOBEC1及PmCDA1脱氨酶结构域融合，xCas9 （D10A）碱基编辑器可以有效介导5’-NGG-3’ PAM位点的C to T碱基编辑，且其碱基编辑活性及特性与野生型SpCas9（D10A）对应碱基编辑器相比未见明显变化（Figure 1C）；

Figure 1. 植物xCas9基因组编辑系统介导的5’-NGN-3’ PAM位点编辑活性通量分析

2、水稻原生质体瞬时表达+扩增子NGS分析结果表明：1）所有16种5’-NGN-3’ PAM位点中，Cas9-NG及Cas9-NGv1均可显示有效编辑活性（Figure 2A）；2）经典的5’-NGG-3’ PAM位点处，Cas9-NG及Cas9-NGv1编辑活性明显低于野生型SpCas9（Figure 2A）；3）Cas9-NG及Cas9-NGv1在5’-NGT-3’ PAM位点显示明显的编辑活性偏好（Figure 2A）；4）Cas9-NG编辑活性整体优于Cas9-NGv1（Figure 2A）；5）在非5’-NG-3’（5’-GAA/GAT/CAA-3’）PAM位点，Cas9-NG与Cas9-NGv1均表现出强于xCas9及野生型SpCas9的编辑活性（Figure 2B）；

Figure 2. 植物Cas9-NG基因组编辑系统介导的5’-NGN-3’及非5’-NG-3’ PAM位点编辑活性通量分析

3、通过与rAPOBEC1及PmCDA1脱氨酶结构域融合，Cas9-NG（D10A）碱基编辑器可以有效介导5’-NG-3’ PAM位点的C to T碱基编辑，并获得明确的碱基编辑再生事件（Figure 3）。

Figure 3. 基于植物Cas9-NG基因组编辑系统的C to T碱基编辑

该研究论文通讯作者为电子科技大学张勇教授、马里兰大学Yiping Qi博士，电子科技大学生命科学与技术学院博士生仲昭辉、任秋蓉及马里兰大学博士生Simon Sretenovic为论文共同第一作者，研究工作得到了国家自然科学基金、国家转基因重大专项、美国自然科学基金、四川省青年基金、江苏特聘教授启动基金、江苏作物基因组学和分子育种重点实验室开放课题等项目资助。