叶绿体是植物光合作用的场所，维持着地球上的有氧生命活动。它由一对紧密间隔的膜包围而成，即叶绿体内被膜和外被膜。它们在结构和功能上都有差异，因此必须将他们分离开来以供研究。另外，叶绿体是相对较大的细胞器，可通过电子显微镜观察其超微结构。西北农林科技大学殷俐娜课题组描述了一种从烟草中分离叶绿体内外膜的可靠方法，以及用透射电子显微镜（TEM）观察烟草叶绿体超微结构的方法。

在Plant Physiology发表的研究工作中，殷俐娜等研究人员借助分离叶绿体内外膜及用透射电镜观察叶绿体超微结构的实验方法，揭示了膜脂在植物盐胁迫响应中对叶绿体结构和功能的调节作用，相关技术实验流程分别以Isolation of Chloroplast Inner and Outer Envelope Membranes 和Transmission Electron Microscopy for Tobacco Chloroplast Ultrastructure为题整理发表在Bio-Protocol杂志，供研究人员参考。

从植物细胞中分离出完整的叶绿体是成功获得叶绿体内、外膜的重要前提。由于叶绿体里有累积的淀粉，其质量相对较大，因此在进行离心分离的时候容易造成叶绿体的破碎。对于烟草来说，可以将植物放在较弱的光下生长2-3天，以减少淀粉的累积。此外，需严格控制离心的速度，以减少叶绿体的破坏。之后可通过以下方式分离内、外被膜：1）蛋白酶处理法和2）离心法。离心法可得到较纯的内外被膜，因此适合做随后的分析，此外，离心法可以避免蛋白酶处理过程中内被膜中多肽的破坏（一些蛋白酶可进入内膜），且离心法易于操作并得到完整的包膜，仅包含较少的外被膜和内被膜的粘附区域。

图1. 用40%和90%的Percoll离心后的叶绿体粗体液。上层是破碎的叶绿体，下层绿色部分是完整的叶绿体，管底部的白绿色是淀粉。

叶绿体的直径约为5μm，宽度约为2.5μm，由叶绿体被膜、类囊体和基质三部分组成，基质部分包括淀粉颗粒和塑性球蛋白，它们可通过电子显微镜观察到。类囊体结构对环境变化非常敏感，例如干旱、盐胁迫、寒冷、高温等均会一起叶绿体结果的改变。透射电子显微镜是一种强大的分析技术，可用于观察不同处理对植物重要细胞器的发育和分化的影响。

借助叶绿体内外膜分离及用透射电镜观察叶绿体超微结构的实验方法，研究人员发现超表达水稻单半乳糖甘油二酯合酶MGD基因的烟草在盐胁迫条件下具有发育良好的类囊体膜和适当堆叠的基质片层，而野生型烟草的类囊体膜在盐胁迫下结构发生紊乱，具有较大的无膜区域。研究发现，在烟草中过量表达OsMGD能显著提高植物的耐盐性，并且半乳糖脂MGDG和DGDG对叶绿体的结构和功能调节发挥重要作用，能缓解烟草所受的盐胁迫，提高植物的抗逆性。

殷俐娜课题组简介

殷俐娜课题组主要从事植物膜脂对逆境的响应机制，以及硅缓解植物逆境伤害的机理方面的研究。在植物膜脂响应不同非生物胁迫研究领域做出了一系列原创性成果。首次证明植物膜脂与植物抗逆性之间的关系，发现了植物膜脂对叶绿体结构和功能起重要的调节作用，为植物在逆境条件下的适应性生存策略提供了全新的思路。代表性成果发表在Plant Physiology, Physiologia Plantarum, Annals of Botany, Plant Cell and Environment, Journal of Experimental Botany等期刊上。

参考文献

Wang, S.W., Uddin, M. I., Tanaka, K., Yin, L.N., Shi, Z.H., Qi, Y.H., Mano, J., Matsui, K., Shimomura, N., Sakaki, T., Deng, X.P. Zhang, S.Q. (2014). Maintenance of chloroplast structure and function by overexpression of the rice MONOGALACTOSYLDIACYLGLYCEROL SYNTHASE gene leads to enhanced salt tolerance in tobacco. Plant Physiol. 165(3): 1144-1155.

Wang, S.W., Yin, L.N., Mano, J., Tanaka, K. (2015). Isolation of chloroplast inner and outer envelope membranes. Vol 5, Iss 4. http://www.bio-protocol.org/e1405

Yin, L.N., Wang, S.W., Shimomura, N., Tanaka, K. (2015) Transmission electron microscopy for tobacco chloroplast ultrastructure. Vol 5, Iss 4. http://www.bio-protocol.org/e1404