近日，东京大学医学研究所Yoshihiro Kawaoka等人评估了长期培养的A549细胞对人类流感病毒的易感性。相关研究以Long-term culture ofhuman lung adenocarcinoma A549 cells enhances the replication of humaninfluenza A viruses发表在Journal of GeneralVirology杂志上。
长期培养的A549细胞会促进其向肺泡II型细胞表型分化，研究者将A549细胞在Ham的F12K培养基中连续培养25天(D25-A549)或1天(D1-A549)。结果发现，6种人甲型流感病毒在D25-A549细胞中的生长速度明显快于在D1-A549细胞中的生长速度；然而，两种B型流感病毒在两种细胞类型中复制都很差；两种禽流感病毒在两种细胞类型中均有效复制，具有相似的滴度；人病毒受体在D25-A549细胞中的表达水平高于D1-A549细胞。与D1-A549细胞相比，D25-A549细胞更有效地支持人甲型流感病毒的复制，表明长期培养的A549细胞将更有助于人甲型流感病毒的研究。
研究背景
流感病毒属于正粘病毒科，基因组由单股负链分节段RNA分子组成。可以分为四种不同的类型:A、B、C和D。其中，流感病毒A和流感病毒B在全球每年流感流行期间造成严重的发病率和死亡率。此外，甲型流感病毒导致流感大流行，对全球健康和经济造成毁灭性影响。
腺癌人肺泡基底上皮细胞A549已被广泛用于甲型流感病毒复制的体外研究。然而，该细胞系对某些甲型流感病毒株的生产性感染表现出较低的容受性。最近研究报道了A549细胞的长期培养导致这些细胞向肺泡II型细胞表型分化。本研究则评估了长期培养的A549细胞对人类流感病毒的易感性。结果表明，长期培养的A549细胞将有助于流感病毒研究，特别是涉及人类甲型流感病毒的研究。
已有研究表明，在Ham的F12营养培养基(Ham的F12K)中长期培养的A549细胞会促进其向肺泡II型细胞表型分化。研究者在含10% FCS的Ham’s F12K中培养A549细胞，制备了分化的A549细胞。细胞以1.5-2×104细胞cm2接种于12孔板上，37℃、5%CO2连续培养25天，每2-4天更换一次培养基。所有实验均采用在Ham F12K培养基中培养25天(D25-A549)或1天(D1-A549)的A549细胞。
主要结果
1、长程培养的D25-A549细胞的形态学特点分析。肺泡II型肺细胞具有特征性的电子致密的多层胞体，A549细胞的长期培养促进了这些胞体的形成。为了证实D25-A549细胞中多层胞体的表达，研究者用薄层电子显微镜观察了D25-A549细胞。透射电镜观察发现，D25-A549细胞中含有许多层状体(图1)。相比之下，在Ham的F12K中培养1天的A549细胞D1-A549中，几乎没有发现多片胞体。该结果表明长程培养的D25-A549细胞促进其向肺泡II型细胞表型分化。
图 1 长期培养A549细胞的形态学特征。
2、细胞表面α2,6和α2,3糖苷键的表达分析。流感病毒与上皮细胞表面糖蛋白和糖脂上的含唾液酸的多糖结合引起感染。人流感病毒倾向于结合α2,6糖苷键，而禽流感病毒优先结合α2,3糖苷键。研究比较了细胞表面唾液酸表达水平，发现D25-A549细胞和D1-A549细胞α2,6糖苷键的唾液酸表达无差异，但D25-A549细胞比D1-A549细胞可表达更丰富的含α2,6糖苷键的唾液酸(图2)。
图 2细胞表面α2,6和α2,3糖苷键的表达分析。
3、不同亚型流感病毒复制情况比较分析。为了确定长期培养A549细胞是否能增强人流感病毒在这些细胞中的复制，研究检测了不同病毒株[1株A/H1N1, 2株A/H1N1 2009流感大流行(A/H1N1pdm)，3株A/H3N2和2株B]在D25-A549细胞中的生长动力学。分别以m.o.i.为0.01的病毒感染在12孔板上培养的D25-A549和D1-A549细胞。最后采用空斑法测定MDCK细胞培养上清液中病毒滴度。结果发现，所有6种人类甲型流感病毒在D25-A549细胞中比在D1-A549细胞中生长得更快，并且在感染后48小时内具有更高的滴(图3a)。相比之下，两种B型流感病毒在D25-A549和D1-A549细胞中均生长较差(图3b)。此外，研究比较了从人类分离的两种禽流感病毒(一种A/H5N1和一种A/H7N9)在D25-A549和D1-A549细胞中的生长动力学，感染病毒的m.o.i.分别为0.001，并在MDCK细胞中通过空斑法测定病毒滴度。这些禽流感病毒在D25-A549和D1-A549细胞中有效复制，并且在滴度上没有显著差异(图3c)。这些结果表明，长期培养A549细胞比短期培养A549细胞更有效地支持人甲型流感病毒的复制。
图3.不同亚型流感病毒生长曲线比较分析。
4、宿主因素影响分析。D25-A549细胞表明具有更多的α2,6受体可提高强度的病毒与受体相互作用,因此在人流感病毒感染时会显示更高的灵敏度。此外，与短期培养的A549细胞相比，长期培养的A549细胞中有大量基因表达上调或下调。多种宿主因素可能参与了D25-A549细胞中病毒滴度的增加。LAMP3(溶酶体相关膜蛋白3)这一宿主因子在流感A病毒的复制中发挥重要作用。Real-timePCR结果显示，D25-A549细胞表达的LAMP3mRNA水平高于D1-A549细胞(图4)。因此，在D25-A549细胞中较高的LAMP3表达可能会增强对人类甲型流感病毒的复制。当然，还需要进一步的研究来确定哪些宿主因素参与了D25-A549细胞中人类甲型流感病毒的增强复制。
图4 D25-A549细胞和D1-A549细胞的LAMP3基因表达的相对比值。
ABSTRACT
Long-termculture of the human lung adenocarcinoma cell line A549 promotes thedifferentiation of these cells toward an alveolar type II cell phenotype. Here,we evaluated the susceptibility of long-term cultured A549 cells to humaninfluenza viruses. A549 cells were cultured continuously for 25days(D25-A549) or 1 day (D1-A549) in Ham’s F12K medium. Six human influenza Aviruses grew much faster in D25-A549 cells than in D1-A549 cells; however, twoinfluenza B viruses replicated poorly in both cell types. Two avian influenzaviruses replicated efficiently in both cell types, with similar titres.Expression levels of human virus receptors were higher in D25-A549 cells thanin D1-A549 cells. D25-A549 cells thus more efficiently support the replicationof human influenza A viruses compared with D1-A549 cells. Our data suggest thatlong-term cultured A549 cells will be useful for influenza A virus research.
1.UjieM, Takada K, Kiso M, Sakai-Tagawa Y, Ito M, Nakamura K, Watanabe S, Imai M,Kawaoka Y.Long-term culture of human lung adenocarcinoma A549 cells enhances thereplication of human influenza A viruses.J Gen Virol. 2019 Aug 19. doi:10.1099/jgv.0.001314.
本期编辑：Annabella
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