CRISPR/Cas9基因编辑工具为开发遗传性疾病、某些癌症甚至顽固病毒感染的新疗法带来了希望。

然而，通常用作CRISPR/Cas9递送系统的病毒载体对治疗性基因组编辑提出了安全性挑战。另一方面，非病毒的阳离子脂质体组分或聚合物可用于将多种CRISPR组分包封成大颗粒(通常直径>100nm)，然而，这种系统也受到货物装载变化等限制。

为了解决现有递送挑战，威斯康辛大学麦迪逊分校的研究人员设计了一种用于递送Cas9核酸酶和单指导RNA(sgRNA)的可定制合成纳米胶囊，实现CRISPR组分的受控化学计量，并避免体内潜在的安全性问题。

相关研究结果于2019年9月9日发表在 Nature Nanotechnology 杂志上，为此类基因治疗的病毒递送提供了替代方案。

宫绍琴(Shaoqin Gong)教授是该论文的通讯作者之一，现任美国威斯康辛大学麦迪逊分校生物医学工程系和威斯康辛Discovery研究所的Vilas杰出成就教授，也是美国医学与生物工程学会会士(AIMBE Fellow)。1991年，宫教授在清华大学获得材料科学与工程和经济管理双学士学位；1994年，在清华大学获得材料科学与工程硕士学位；1999年，在密歇根-安娜堡大学获得材料科学与工程博士学位。

宫教授及其团队

宫教授团队致力于设计和建造用于靶向治疗的纳米级递送系统，提供各种有效载荷，包括小分子药物、蛋白质、DNA、RNA和基于CRISPR的基因组编辑剂等。这允许更具特异性地向靶器官或细胞递送药物，同时增强其在血液循环中的稳定性。

宫教授说：“病毒载体很有吸引力，因为它们可以非常有效，但它们也与许多安全问题有关，包括不受欢迎的免疫反应。”为了编辑细胞中的基因，编辑工具需要安全有效地植入细胞。

此外，基因治疗中新的细胞靶点也可能需要费力地改变病毒载体的特异性，而定制病毒载体的制造可能相当复杂。

Cas9-RNP (核糖核蛋白)复合物是一种有吸引力的CRISPR介导基因编辑的非病毒制剂，具有DNA切割活性快、低靶点效应、插入突变风险低、易生产等优点。此外，RNP不依赖于转录或翻译细胞机制来进行精确的酶基因编辑活动，也不依赖于可以整合到基因组中的长核酸或基于病毒的方法。

然而，现有的Cas9-RNP的非病毒递送策略面临着许多挑战，如细胞毒性高、体内稳定性差、颗粒尺寸大、缺乏特定的组织和/或细胞靶向能力、RNP载货量变化和潜在的免疫原性。

这些挑战限制了RNP在基因编辑中的应用，特别是在体内，其中化学定义的稳定和现成制剂可能对体细胞基因编辑的转化应用至关重要。

为此，威斯康辛大学麦迪逊分校的研究人员开发了一个可定制的高效纳米平台，为在体和离体应用提供Cas9 RNP复合物。

该研究团队通过原位聚合合成，设计了一种直径约25nm的纳米胶囊(NC)，其外壳涂有薄的谷胱甘肽(GSH) - 可切割的共价交联聚合物，用来包裹Cas9核酸酶和sgRNA之间的预装配核糖核蛋白(RNP)复合物。

具体设计原理如下：

该纳米胶囊用于递送CRISPR组分具有以下优势：

  • 在细胞质内寿命短，因此有望减少非靶基因编辑；

  • 表面可以用官能团修饰，能够方便地定制以靶向某些细胞类型；

  • 此外，纳米胶囊可以冷冻干燥，因此可以方便地作为粉末进行纯化、储存和运输，同时为剂量控制提供灵活性。

该项目结合了威斯康辛大学麦迪逊分校在化学、工程、生物学和医学方面的专业知识。目前，威斯康辛校友研究基金会的研究人员正在申请纳米胶囊的专利。

实现在体内外的高效编辑

首先，研究团队比较了基于NC与脂质体 (Lipofectamine)递送载体的体外基因编辑功能。目前，如Lipofectamine 2000(Lipo)和Lipofectamine CRISPRMAX的脂质体是用于RNP递送的最先进的市售转染剂。

与未处理的对照组相比，单独使用RNP仅在背景水平以上诱导1.6±0.5％的编辑，这显著低于Lipo(60.1±1.7％)或NC(79.1±0.6％)所呈现的编辑，其中NC表现出来最高的编辑效率。

此外，NC在HEK 293细胞中没有引起明显的细胞毒性(<6％细胞死亡)，而与其他研究一致，Lipo在用于递送相同量的RNP时显示出显著的细胞毒性(~25％细胞死亡)。

重要的是，NC可以冷冻干燥并以高浓度(~5μg/μl RNP)重建，同时保持效力(>90％)，这与许多在冷冻干燥时失去稳定性的脂质体递送剂不同。

为了证明NC表面修饰的通用性，他们使用CPP(已知可以提高纳米颗粒的细胞吸收效率)对NC进行功能化。体外实验结果表明，NC修饰可以增强内源性、治疗相关位点的基因组编辑，而不改变Cas9产生的编辑类型。

最后，[另外两位通讯作者]儿科学和眼科教授Bikash R. Pattnaik和比较生物学教授Masatoshi Suzuki及其团队分别演示了使用NC对小鼠眼睛和骨骼肌进行的基因编辑。结果发现，经视网膜下注射和肌肉注射的局部给药在小鼠视网膜色素上皮(RPE)组织和骨骼肌中产生强有力的基因编辑。

总之，这种可定制的NC纳米平台能有效地提供CRISPR RNP复合物用于离体和在体的体细胞基因编辑。

宫教授表示，纳米胶囊体积小、稳定性好、表面修饰的通用性和编辑效率高，使其成为许多类型基因疗法的一个有前景的平台。团队下一步将优化正在研究的纳米胶囊，以便有效地在大脑和眼睛进行编辑。