2019年8月，国际顶级期刊《新英格兰医学杂志》（简称NEJM）发表了题为《Gene Therapy》的最新综述，从基本原理出发，介绍了目前为止基因治疗的临床应用和上市药物，并着重讨论了基因治疗现阶段存在的问题和挑战。 本文基于这篇综述，重点从病毒载体的角度来介绍一下当前基因治疗的发展现状。
传统药物面临挑战，基因药物蓄势待发
现代医学目前还以化学疗法，放射疗法和外科手术为主。其中许多药物都是化学合成药剂，旨在改变身体的化学反应并产生依赖性，并且通过减少疾病的症状和延长患者的寿命来实现暂时的缓解。然而，这些传统药剂面临许多挑战：包括溶解度和生物利用度低，体内物理化学性质不稳定，循环半衰期短，体内渗透性低，组织分布性差以及高剂量易引起毒性。
以蛋白类药物为例，基于蛋白质和肽类的药物已成为目前市面最常用的治疗药物，目前全世界有近380种市售药物。然而，将治疗性蛋白质引入患者体内的一个不利因素将会导致严重的免疫反应，炎症和发热症状。为了解决这一系列的问题，高质量治疗性蛋白质的生产工艺变得极为复杂，但是目前开发治疗性蛋白的工艺涉及5000多个关键步骤。因此，开发化学和蛋白疗法的不可预测性太高，时间和投入成本太大。
基因疗法能实现治疗性蛋白的长期表达和组织特异性表达，无需药物干预，放疗或手术治疗，即可从根源上解决传统疗法存在的一系列问题。并且这一新兴的治疗方法可针对单基因遗传病，心血管疾病，免疫缺陷性疾病和癌症等多种疾病。
2010年以前基因治疗处于迂回式发展，挫折性前进。直到2010之后，随着基因治疗“科学”的进一步成熟，载体安全性和传递效率的提升，才最终促成了重大的临床进展。尤其2016年以来，欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）批准了六种基因治疗产品（图一），极大加速了基因治疗的发展。
基因治疗的基本原理及分类
基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，能实现治疗性蛋白的长期表达和组织特异性表达，无需药物干预、放疗或手术治疗，即可从根源上解决传统疗法存在的一系列问题 [1]。并且这一新兴的治疗方法可针对单基因遗传病、心血管疾病、免疫缺陷性疾病和癌症等多种疾病。基因治疗包括在体基因治疗和离体基因治疗（CAR-T等）（如下图所示）
图2. 基因治疗的2种方式（体外-左；在体-右）
离体基因治疗：由于利用自体细胞，因而不会产生免疫反应；同时还可在体外筛选到高效转导以及无脱靶的细胞，进而实现高效安全的治疗效果。但由于步骤繁琐，细胞活力低等缺点也受到一定的局限。此外，整合型载体的使用更易引起体内的随机插入，进而产生癌变也是亟需解决的问题之一。
在体基因治疗：由于其操作简便，对于一些体外无法培养的细胞类型是最优选择。但由于体内编辑的不确定性，无法避免很多随机整合或脱靶等事件，并且一些病毒载体还会使机体出现危及生命的免疫反应。因此，开发和优化新型的基因递送载体系统，使治疗基因能更安全有效地递送到靶向细胞或组织，将极大地促进基因治疗在临床应用中的进程。
理想的载体是基因治疗的关键
如上所述，不管是体内还是体外基因治疗，理想载体的选择是基因治疗成败的关键，它们应该具备以下几个特点：
因此，寻找合适的载体一直是基因治疗的重要研究领域。目前针对基因治疗的载体一般分为病毒和非病毒载体。下图展示了临床试验中各种递送载体的占比情况，病毒载体是基因疗法最常用的递送系统（主要包括ADV、RV、AAV等），它也是世界上第一个用于基因治疗的临床研究载体。
图3. 不同载体的临床试验占比
1. 非病毒载体：主要通过物理和化学方法来转导治疗性遗传物质，包括针，基因枪，电穿孔，声孔效应，光致成像，磁场转换，加氢，机械按摩，脂质体，磷酸钙，二氧化硅和金纳米粒子等。然而，由于它们操作复杂且存在固有的缺陷，其在基因治疗的效果无法满足临床的需求。
2. 病毒载体：相较于非病毒载体，病毒载体更符合理想载体的要求，因此，大量研究人员正集中开发新型的病毒载体，以求基因治疗能够安全有效地治愈人类疾病。
病毒载体是基因治疗产业化的主要挑战
基因治疗在历史上曾出现两次重大危机，均与载体技术直接相关。一次是由于使用了免疫原性强烈的腺病毒载体，在病人体内引起了过度的免疫反应并最终导致病人的死亡；另外一次由于逆转录病毒整合突变效应激活了癌基因，导致接受基因治疗的20名病人当中5位出现了白血病病征 。因此，降低病毒载体的免疫原性与随机插入导致基因突变的风险，开发和优化新型的基因递送载体系统，将极大地促进基因治疗在临床应用中的进程。 从成本考虑，Glybera退市的很重要原因之一为价格昂贵。而制造定制病毒的费用占生物技术公司开发预算的1/3甚至更多，因此规模化的载体生产能力将是降低研发成本、上市后获得价格优势的关键技术。全球来看，基因疗法CDMO行业获得病毒平均等待时间为16个月，某些情况下甚至为两年 。导致病毒产能严重不足的原因除了自2017年基因治疗首次获得FDA批准以来的需求激增，更主要的是病毒载体比传统生物制剂更难制备。 同时在可预见的将来，尚未有其他载体可以替代病毒载体在基因治疗商业化中的主导地位。 迄今为止有2/3的临床试验通过病毒载体进行。 用于基因治疗的最常用病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒（AAV）和慢病毒，其中AAV是使用最广泛的（70％的基因疗法）。非病毒载体主要通过物理和化学方法来转染治疗性遗传物质，包括针、基因枪、电穿孔、声孔效应、磁场转换、质粒、脂质体、细菌载体和金纳米粒子等。但体内转染效果差以及毒性过大严重制约了非病毒载体的临床转化。
图4：主要病毒载体比较 [5]
图5：病毒与非病毒载体的对比
详细介绍目前已被用于基因治疗的几种病毒载体
逆转录病毒载体（RV）
1. RV在临床试验中最新进展：
迄今为止RV载体已进行了500多项基因治疗的临床试验，如癌症，地中海贫血，HIV，ADA-SCID，黑素瘤，WAS等，下表罗列了目前已开展的基于RV的重要临床试验研究：
2. RV载体用于临床试验存在的主要问题和解决方案：
腺病毒载体（ADV）
1. ADV在临床试验中最新进展：
ADV载体在整个病毒介导的临床研究中的比例约24%（如上图所示），主要集中在疫苗接种和溶瘤治疗，也正被测试用于疟疾，炭疽，HIV，流感，乙型肝炎和丙型肝炎，以及严重血友病以及心血管和更多疾病的临床试验。下表罗列了目前已开展的基于ADV的重要临床试验研究：
2. ADV载体用于临床试验存在的主要问题和解决方案：
大量临床试验得到了令人鼓舞的结果，特别是在癌症治疗中，预计ADV介导的基因治疗不久的将来会在根除癌症中发挥重要作用。虽然ADV介导的基因治疗较其他系统具有独特的优势，但必须解决以下几个问题才能真正发挥其在临床治疗中的真正潜能：
腺相关病毒载体（AAV）
1. AAV在临床试验中最新进展：
目前AAV载体已被用于200多项临床试验来治疗多种疾病，占所有基因治疗临床研究的8.1%。包括A/B型血友病、先天性黑蒙症、遗传性脉络膜视网膜营养不良、全色盲和Leber的遗传性视神经病变（LHON）。此外，还有许多临床试验正在测试用AAV来治疗溶酶体贮积症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、癫痫、1型脊髓性肌萎缩、异染性脑白质营养不良、芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症（AADC），以及巴特病等。下表罗列了目前已开展的基于AAV的重要临床试验研究：
2. 临床试验研究AAV介导的几类重要疾病介绍：
3. AAV载体用于临床试验存在的主要问题和解决方案：
尽管AAV载体是安全非致病的，但它们在基因治疗中的应用受制于有限的装载容量（不超过5Kb），衣壳蛋白引起的免疫原性，生产工艺困难，大剂量高度纯化载体的需求，普遍的趋向性以及在人群中存在广泛的抗AAV抗体（208-211）。基于AAV的基因治疗是目前最为安全有效的治疗方式，因而优化AAV病毒载体对于基因治疗在临床中的应用至关重要：
病毒大规模生产壁垒非常高
资金壁垒
属于重资产行业，建立符合 cGMP 要求的设施对资本要求很高，前期需要大量资本投入，建设一座新的厂房投资可能高达数亿美金。 大规模生产成本包括设备仪器、原材料/消耗品以及人才成本等。仪器设备（生物反应器）现在绝大部分依靠从美国进口，包括默克、赛多利斯、通用电气、颇尔、艾贝泰等；生产过程中用到的原材料和耗材同样如此，包括培养基、填料、一次性反应袋、接口管道等。 我们已经逐渐关注到了一些开发和销售培养基的国产企业，而致力于开发国产填料的企业则相对较少。所以，国内病毒制造除了在人才成本上有些许优势（高级别人才成本差别不大），和欧美制造商相比在生产成本方面没有太大优势。
技术壁垒
病毒载体的生产是定制的，没有“one-size-fits-all”的解决方案。载体的选择取决于目标器官/组织和治疗基因片段的大小。业界正在不断努力开发具有改进工艺结果的病毒载体平台，例如CAP-GT（CEVEC）、LentiVector（Oxford Biomedica）和NAV技术（ Regenxbio）。
图6：不同类型病毒的制备流程
人才壁垒
缺乏具有病毒经验的训练有素的人员。疫苗制造是最密切相关的领域，但仍然不尽相同。国内病毒相关人才更为匮乏，需到海外去找，或者从相近的疫苗行业转型。
运营管理壁垒
需要建立成熟可靠的质量控制、成本及效率控制和 EHS 管理体系。尤其是质量控制，其挑战在于改进病毒载体配方，使其在低温和高温下具有更高的稳定性，以及严格的无菌产品灌装线，避免额外的无菌过滤 [6]。国家药典委在今年6月份发布的《人用基因治疗制品总论》（草案）给企业质控方面提供了更多的指导。
国内外病毒大规模生产差距明显
图7-图9列举了美国、欧洲和中国的主要基因治疗CDMO公司。主要差异体现在以下方面： 1. 国内CDMO成立时间大部分在2015年以后，缺乏技术和经验上的积累，能够达到临床级别病毒生产的只有寥寥几家。而国外临床级别的开发已经趋于成熟，正在朝商业化大规模生产发展，并且近几年由于行业产能不足，几乎所有欧美主要CDMO都增加了产能，预计在未来几年内将增长约40％ [2]。 2.国外基因治疗生物科技公司倾向于病毒生产外包，65％临床阶段的基因疗法选择外包（与传统生物制剂的35％相比） [2]。国内基因治疗公司由于CDMO扩大化工艺水平经验不足，并且市场还在起步阶段，临床试验数以及所需病毒量少，以及为了更好的CMC灵活性，更倾向于自建管线生产。 3.国外基因治疗CDMO专业度更高，有的专注于质粒生产，有的只专注于AAV或是慢病毒生产，有的只提供质控管理与测试，而国内服务商倾向于提供全流程所有类型病毒的一站式生产服务。
图7：美国主要基因治疗CDMO
图8：欧洲主要基因治疗CDMO
图9：中国主要基因治疗CDMO
（到2019年11月不完全统计）
欧美病毒载体制造商巨头尚不能满足当地市场以及病毒进出口严格的问题，因此国内的基因治疗公司需要不断地进行大额融资来自己解决病毒产能问题。同时，这也为国内的CDMO提供了一定的市场空间。但国内市场处于早期起步阶段，市场容量小并且还需要培养，国内基因治疗CDMO需要有与欧美CDMO对接合作的能力甚至是拓展国际市场的潜力。
已上市的基因治疗药物
随着病毒递送载体和基因编辑技术的进步，自2003年以来，至少有十几种基因治疗产品问世（如下图所示）：
图10. 近年来上市的基因治疗药物
全球资本市场对基因治疗领域投融资及并购异常火热
全球资本市场对基因治疗领域投融资及并购异常火热，2018年全球基因疗法的融资额同比增长了一倍以上。大型生物制药公司正越来越多地寻求接触这一新的治疗类别，并于2017年开始一系列收购 。
图5：全球基因治疗公司融资额（$B）
图6：迄今全球基因治疗公司并购事件（$B）
新兴基因编辑技术推动临床发展
截至目前，基于基因疗法的临床试验及上市药物主要以外源基因增补的方式通过病毒递送来治疗疾病，虽然这一方式取得了显著疗效，但仍然无法实现疾病长期治愈的可能，这主要归因于病毒载体（如慢病毒）插入突变，ADV载体显著的肝毒性以及AAV载体以游离态形式会随细胞分裂增殖而丢失，或因产生的迟发性免疫反应所清除等诸多因素。为了解决这一问题，新兴的以核酸内切酶为基础的基因编辑技术（如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9）正被科学家们开发用于疾病的治疗。
基因编辑技术通过核酸内切酶靶向切割基因组形成DSBs，通过NHEJ的方式产生Indel导致基因敲除，在有模板存在的条件下可通过NHEJ或HDR的方式发生靶向整合，对异常基因进行定点修复或将治疗基因靶向整合到基因组中，成功编辑的细胞可以传递给子代，以实现疾病的长期修复效果。
随着病毒载体和基因编辑技术的不断优化，基于基因编辑技术的多项临床试验也陆续在进行中，其中包括：
最后
基因治疗的未来会朝着更安全、更高效的载体工程方向发展，结合多种现有策略，如病毒载体与基因工程技术相结合，针对患者进行个性化基因治疗。总之，基因治疗的进展为许多迄今无法治愈的疾病带来了令人兴奋的新治疗机会。然而，要克服这类新型药物带来的困难险阻并实现其全部治疗潜力，我们仍需要强有力且持续的合作努力。
随着更多基因治疗临床试验的进行，今后将会出现更多的基因治疗药物批准上市，更多类型疾病的治疗将不再是梦想。然而，我们也要认识到目前已上市的基因治疗药物所存在的问题，诸如审批流程复杂、价格昂贵以及需求量低等，建立合理的审批流程、制定合适的定价策略，将会为基因治疗药物的发展提供充足的保障。
本期整理编辑：苏复
来源：
1、中国实验动物信息网https://www.lascn.net/Item/79603.aspx
2、 蓝色彩虹https://mp.weixin.qq.com/s/Y1pojfhRnrd6Hjm_0lux6g
内容涉及文献：
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[2] "Cell & Gene Therapy Deep Dive," J.P. Morgan, 2019.
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