撰文 | 十一月
责编 | 兮
2019年1月31日，波士顿大学医学中心崔儒涛教授、厦门大学生科院邓贤明教授、复旦大学附属肿瘤医院王鹏教授组成的研究团队合作在Cell上发文题为Pharmacological Targeting of STK19 Inhibits Oncogenic NRAS-Driven Melanomagenesis，发现丝氨酸/苏氨酸激酶STK19（Serine/threonine kinase 19）作为可以作为NRAS的激活因子发挥作用，STK19通过磷酸化NRAS以增强其与下游效应因子的结合促进NRAS介导的黑素细胞恶性转化【1】。作者们通过开发靶向STK19的小分子抑制剂发现可通过该抑制剂有效抑制NRAS介导的黑色素瘤的发生和发展，有望发展成为NRAS介导黑色素瘤的靶向药物（详见BioArt报道：Cell丨崔儒涛/邓贤明/王鹏合作组报道首例STK19靶向化合物抑制NRAS介导的黑色素瘤生成）。
2020年6月11日，英国弗朗西斯·克里克研究所Jesper Q. Svejstrup研究组（以下简称Svejstrup组）对该研究提出质疑，在Cell发表文章Evidence That STK19 Is Not an NRAS-dependent Melanoma Driver，对STK19在NRAS依赖的黑色素瘤中作为驱动因子发挥功能的论点进行了挑战。
Svejstrup组关于2019年Cell文章质疑的开始，是对STK19基因的注释。在2019年的Cell文章中，崔儒涛教授研究团队主要集中在一个41 kDa大小的STK19亚型上。此41 kDa大小的STK19亚型在整篇文章中都有使用，而且几乎所有重要概念的实验都基于这个大小的STK19。STK19处在MHC III基因座上（图1），而前人的鉴定发现该基因位点上的基因非常密集【2】，这可能会造成基因注释的错误。而且Svejstrup组提出41 kDa STK19的蛋白大小是起源于30年前的最初注释，考虑到该基因所在位点的复杂性以及当时可用的工具，错误是可以理解的。
图1 MHC III基因座上密集存在各种基因
Svejstrup组认为2019年的Cell文章中STK19蛋白亚型有误，正确的版本不包含第一个110个氨基酸的外显子，蛋白大小是29kDa。Svejstrup组的主要依据是，首先STK19氨基酸的保守严格限制在编码29kDa蛋白的区域，在其他的后生动物中前110个氨基酸并不保守（图2），带来这一现象的原因很有可能就是基因注释的错误。第二，基因组分析CAGE、TT-Seq、RNA-Seq、qPCR和剪接连接的深度测序分析均表明，STK19 转录起始位点位于目前注释的外显子1和2连接处的下游。第三，对内源表达STK19基因的细胞或另外含有模拟基因起始外显子结构的细胞进行mRNA分析、蛋白质谱分析和Western blotting分析，证实在多种细胞系中只有存在29 kDa的STK19蛋白表达，而不存在41 kDa的亚型。
图2 人与小鼠STK19基因同源性比对，N端前110个氨基酸几乎没有任何同源性
既然STK19蛋白的长度都存疑，Svejstrup组进一步对2019年的Cell文章中提到的STK19存在突变位点D98N促进NRAS依赖的黑色素瘤生成的功能提出质疑。因为Svejstrup组鉴定的STK19的长度较短，D98N的突变位点位于Svejstrup组认为的非编码蛋白质区域。那么，Svejstrup组认为，就算是D98N发挥功能的话那也是作为调控区域影响STK19的转录或者翻译水平。但是通过他们建立的模拟基因系统（在基因原位末尾加入标记物6xFlag）（图3），在野生型或者是引入D98N突变后，Svejstrup组发现这一突变既不影响转录起始位点的选择也不影响亚型的剪接作用，进一步地Svejstrup组还发现引入突变后STK19基因表达量和蛋白表达量也没有太大的变化。由于“D89N”似乎是紫外线诱导的突变，Svejstrup组在紫外线照射之后对检测该突变是否影响STK19的表达，但是结果也同样是没有呈现出较大的变化。因此，Svejstrup组认为STK19中存在一定几率出现D89N的突变，但该突变只是启动子区域没有功能的突变。
图3 Epr基因模拟系统
另外，Svejstrup组对于2019年Cell文章的质疑还有一点是对STK19激酶身份。崔儒涛教授团队提出STK19作为激酶在质膜上磷酸化NRAS。NRAS通过招募效应因子到质膜激活细胞质信号通路的【3】。但是Svejstrup组发现，29kDa版本的STK19在细胞质中完全没有定位，该版本蛋白定位在细胞核内并且与染色质相关。根据2019年Cell文章中的实验方法，Svejstrup组并没有发现STK19具有激酶活性，也没有发现代表NRAS激活的磷酸化事件的发生。并且由于2019年Cell文章中鉴定小分子抑制剂实验中使用的STK19蛋白只有70%的纯度而非高度纯化的单一蛋白，因此该实验鉴定得到的结果很有可能是STK19相关蛋白或者是混进去的其他蛋白发挥作用而非STK19本身的功能。而且Svejstrup组使用2019年Cell文章中成功使用且可以购买到的41 kDa STK19进行激酶实验后确认STK19并不是NRAS的激酶。
总的来说，Svejstrup组质疑方面重点是STK19基因注释不同，他们认为STK19基因编码的是一个29 kDa的蛋白，而41 kDa 版本的STK19几乎不存在。另外，既然前110个氨基酸都不存在，那么D98N突变体的功能就无从谈起。即使是作为调控区域的突变，Svejstrup组也未检测到该突变体对于STK19表达的影响。除此之外，Svejstrup组对于STK19的激酶身份也提出了疑问，根据Svejstrup组提到的未发表数据来看，他们更倾向由于认为STK19是通过直接结合到DNA上发挥作用的，并且由于Svejstrup组在正文提出STK19蛋白亚细胞定位有问题时，特意只提供了一个STK19-GFP的过度曝光的图片（图4），所以Svejstrup组可能正在对29 kDa STK19具有特殊细胞核定位和其功能开展研究。
图4 29 kDa版本STK19亚细胞定位
Svejstrup组提出质疑后，崔儒涛教授团队在同期Cell上进行了回应。
关于Svejstrup组提出的基因注释可能有误的问题，崔教授团队指出虽然Svejstrup组提出无法在公开的蛋白质数据库直接找到注释前110个氨基酸的数据，但是通过再次分析数据库中的STK19肽段可以发现，41kDa长度的STK19确实存在。通过实验方法部分，崔教授团队发现Svejstrup组使用的培养条件与2019年Cell文章中存在一定的差异，而这可能会影响黑色素瘤细胞的分化状态从而影响STK19的表达量【4】。值得一提的是，在Svejstrup组的质疑文章的黑色素瘤细胞相关的胶图中实际上是能看到41 kDa大小的STK19存在的（图5绿色箭头），只是表达量相较于29kDa的亚型来说丰度较低。可以看出，Svejstrup组进行siRNA敲低之后，41 kDa大小的STK19在黑色素瘤细胞系中的表达并没有变化，说明Svejstrup组敲低基因的方法可能对于41 kDa大小的STK19没有影响，因此没有看到相似的功能表型也就不足为奇了。正是由于在黑色素瘤细胞系中siRNA转染效率很低，所以崔教授团队选择的是shRNA慢病毒转化而非Svejstrup组选用的siRNA转染的方式来提高敲低效率达到基因操作的目的的。
图5 绿色箭头标记的地方41 kDa STK19（Svejstrup组胶图）
BioArt注：绿色箭头为BioArt根据蛋白大小片段添加，非崔教授reply文章中提出。但是在reply中，崔教授提到：（原文）In our study, human STK19 was examined by immunoblotting with human primary melanocytes (HPMs) and melanoma cells, and we detected an isoform of STK19 at 41 kDa whose level was reduced by short hairpin RNA (shRNA)-mediated knock-down. 41 kDa bands were also detectable in melanoma cells in Marta Rodríguez-Martínezs（BioArt注：Jesper Q. Svejstrup文章的一作）studies(Figure 2D，BioArt注：Figure 2D即“无绿色剪头”的图),but the levels were not decreased by their knockdown. One experimental difference between the two studies is the knockdown method. As melanoma cells frequently have low transfection efficiency, we performed the knockdown via shRNA lentiviral transduction, but Marta Rodríguez-Martínezs et al. performed transient transfection of siRNA, whose knockdown efficiency was not consistent (compare HEK293 cells in Figures 2D and 2G).
另外，Svejstrup组用的STK19抗体是：Rabbit polyclonal to STK19（Novus Biologicals，Cat#NBP2-33955）；崔教授用的抗体是：Mouse monoclonal anti-STK19（Novus Biologicals， Cat#H00008859-M01; RRID: AB_607107）和Rabbit monoclonal anti-STK19（Novus Biologicals，Cat# NBP2-33955）。另外，Novus官网这一款（Cat# NBP2-33955）抗体是：Polyclonal（This antibody was developed against a recombinant protein corresponding to amino acids:VLKACDGRPYAGAVQKFLASVLPACGDLSFQQDQMTQTFGFRDSEITHLVNAGVLTVRDAGSWWLAVPGAGRFIKYFVKGRQAVL），另外一款（Cat#H00008859-M01）是：Monoclonal（STK19 (NP_004188 255 a.a. - 364 a.a.) partial recombinant protein with GST tag. MW of the GST tag alone is 26 KDa.QMTQTFGFRDSEITHLVNAGVLTVRDAGSWWLAVPGAGRFIKYFVKGRQAVLSMVRKAKYRELLLSELLGRRAPVVVRLGLTYHVHDLIGAQLVDCISTTSGTLLRLPET）
图：Rabbit monoclonal anti-STK19（Novus Biologicals，Cat# NBP2-33955）来自Novus Biologicals官网
图：Mouse monoclonal anti-STK19（Novus Biologicals， Cat#H00008859-M01; RRID: AB_607107）来自Novus Biologicals官网
另外关于STK19的亚细胞定位问题，崔教授团队提出Svejstrup组检测的是29kDa STK19的亚细胞定位，在对标签标记的41 kDa大小的STK19表达进行了检测后发现41 kDa大小的STK19在细胞质和细胞核中均存在定位（图6）。而关于D98N突变在NRAS驱动黑色素瘤生成的功能实验中，除了崔教授团队还有其他几个独立的研究小组证明了STK19 D89突变在皮肤癌中具有统计学意义的驱动突变【5-7】。另外Svejstrup组发现STK19并不会影响与NRAS相关的磷酸化事件，但是崔教授团队发现在检测磷酸化蛋白的情况下Svejstrup组在实验方法中使用了牛奶和PBST缓冲液，而牛奶中的磷蛋白和PBST中的磷酸盐离子会对某些抗磷特异性抗体产生干扰。关于Svejstrup组指出的激酶实验中使用是细胞提取物而不能排除是STK19相关蛋白发挥激酶作用的论断，崔教授团队表示接受，因为目前的证据不能排除STK19相关蛋白对激酶活性的贡献。
图6 41 kDa STK19亚细胞定位
崔教授团队认为还需要进一步的工作来确定STK19的每一种亚型的潜在分子内相互作用是否被调控以及如何调控，不同亚型是否具有不同的功能以及是否有特殊的亚细胞定位和共同作用的相关因子。最重要的是，未来的工作需要确认哪些与STK19相互作用的激酶可能能够参与磷酸化和激活NRAS。
“理越辨越明，道越论越清”，激烈的思想交锋才能确保科学研究成果的在实践中获得正确的发展。含有NRAS激活突变的黑色素瘤约占20-30%，因此靶向NRAS的研究仍然大有裨益。与之相关的研究工作未来可能会在临床上发挥极大的功能，因此采用审慎的态度面对研究结果才是对病患最负责任的。大数据时代的来临给了科学家以及医疗工作者更宏观的角度去进行研究，但是新的癌症驱动基因的发现仍然需要手工仔细的进行探究和挖掘来确保安全和准确。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.01.002
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.014
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.029
制版人：Kira
参考文献
1. Yin, C. et al. Pharmacological Targeting of STK19 Inhibits Oncogenic NRAS-Driven Melanomagenesis.Cell176, 1113-1127.e1116, doi:10.1016/j.cell.2019.01.002 (2019).
2. Xie, T. et al. Analysis of the gene-dense major histocompatibility complex class III region and its comparison to mouse.Genome Res13, 2621-2636, doi:10.1101/gr.1736803 (2003).
3. Prior, I. A. & Hancock, J. F. Ras trafficking, localization and compartmentalized signalling.Seminars in cell & developmental biology23, 145-153, doi:10.1016/j.semcdb.2011.09.002 (2012).
4. Perng, Y. P. et al. Culture medium induced morphological changes of melanoma cells associated with change in sensitivity to lysis by lymphokine-activated killer cells.Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals12, 317-331, doi:10.1089/cbr.1997.12.317 (1997).
5. Hodis, E. et al. A landscape of driver mutations in melanoma.Cell150, 251-263, doi:10.1016/j.cell.2012.06.024 (2012).
6. Chang, M. T. et al. Identifying recurrent mutations in cancer reveals widespread lineage diversity and mutational specificity.Nature biotechnology34, 155-163, doi:10.1038/nbt.3391 (2016).
7. Garman, B. et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines.Cell reports21, 1936-1952, doi:10.1016/j.celrep.2017.10.052 (2017).
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