生物炭因其独特的理化性质能够提高土壤碳氮矿化速率及改善土壤微生态环境，因此探索生物炭调控土壤微生态环境与土壤酶活及其作用机制对改善土壤质量具有重要意义。采用大田试验方式研究不同生物炭施用水平 0(CK2)、0.6(T1)、0.9(T2)、1.2(T3)和1.5(T4)t·hm -2以及完全空白对照(CK1：不施任何肥料和生物炭)对土壤养分、土壤酶活和细菌群落结构的影响。结果表明，生物炭施用后土壤容重降低，pH 值、速效磷、速效钾、有机质含量和碳氮比均升高，较CK2 处理提高的范围分别为0.32%~5.83%、14.09%~23.16%、0%~38.70%、7.49%~14.16%和4.06%~10.13%。随着生物炭用量的增加，4 个土壤酶活性均呈现先升高后降低的趋势；蔗糖酶(INV)、脲酶(URE)、过氧化氢酶(CAT)和中性磷酸酶(NPH)分 别较CK2 处理提高的范围为63.73%~166.37%、117.52%~174.03%、12.98%~23.59%和60.84%~119.71%。与此相对应的细菌多样性显著提升，尤其是增加了芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和变形菌门(Proteobacteria) 等促生菌的丰度；减少酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)的丰度。相关性分析表明土壤碳氮比是影土壤酶活性的关键影响因素，且土壤酶活又与细菌多样性存在显著的正相关关系；上述4 种土壤酶活与芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度呈现极显著正相关关系(P

土壤微生物是土壤酶的重要来源，土壤中所有的生物化学反应都有土壤酶的参与，土壤酶会影响土壤微生物数量及其群落结构。因此，生物炭施用后根际土壤研究重点之一就是土壤微生物与土壤酶活之间的关系。目前已有大量研究表明施用生物炭能够影响土壤酶活及土壤微生物多样性。Oleszczuk 等的研究通过将生物炭添加到蔬菜地土壤中发现，生物炭能够保护土壤酶且会提高大部分酶的活性。生物炭对不同土壤酶活性的影响是不同的，许云翔等的研究发现施用6a 生物炭后土壤脲酶活性增加量最大能达到36.5%，土壤酸性磷酸酶活性随着生物炭施加量的增加而增加，过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性均降低。如今生物炭对细菌的影响已有大量报道，如Xu 等的研究发现经过生物炭处理后土壤细菌多样性增加，且与生物炭添加量呈正相关。对于生物炭影响土壤细菌的原因，Lehmann 等的研究认为土壤中添加生物炭能够促进细菌与其他菌根形成共生体，改善土壤生态系统中的细菌多样性；同时Ameloot 等的研究发现生物炭能够为土壤细菌提供一个舒适的栖息环境，因此而刺激土壤细菌功能和群落多样性发生变化；也有研究指出生物炭影响土壤微生物的活性和群落结构是由于生物炭可以改变微生物定殖栖息地的理化性质。基于此Nielsen 等提出微生物群落的转变可以与添加生物炭后养分周转和利用的变化相结合。

生物炭在应对农业发展、环境污染、气候变化和能源危机等方面具有重要的潜力。生物炭施用的土壤修复方式能够影响土壤肥力变化的发展方向与程度，而以土壤酶活及土壤微生物特征为代表的土壤生物学肥力又是揭示土壤变化规律和演变趋势的重要指标。目前的研究多聚焦于生物炭对土壤酶活和微生物多样性的影响等方面，但对于土壤酶活与细菌门类的相关关系及其作用机制研究鲜见报道。基于此，本研究通过田间试验，分析了不同生物炭添加量对土壤酶活、土壤细菌群落多样性、细菌门类的影响及其三者之间的相关性，通过探索施用生物炭后驱动土壤微生态变化的机制，以期为土壤保育和根际微生物定向调控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究地点

本试验于2019 年2—10 月于福建省南平市邵武市沿山镇进行，该烟区为烟稻轮作，土壤类型为水稻土，其基本理化性质(0~20 cm 表层土壤)为：pH 值6.29、有机质18.67 g·kg -1 、速效磷21.34 mg·kg -1 、速效钾123.56 mg·kg -1 和全氮0.19 g·kg -1 。供试烤烟品种为K326，由福建省南平市邵武市公司提供。试验生物炭为花生壳原料，由河南省生物炭工程技术研究中心提供。生产工艺条件如下：在 380~400°C条件下低氧、连续炭化20 min 制得，粉碎后过10 目筛，其基本理化性质为：比表面积 16.71 m 2 ·g -1 、容重0.21 g·cm -3 、pH 8.65、全碳524.10 g·kg -1 和全氮2.30 g·kg-1。

1.2 试验设计与处理

本试验共设5 个不同生物炭施用水平：0 t·hm -2 (CK2)、0.6 t·hm -2 (T1)、0.9 t·hm -2 (T2)、1.2 t·hm -2 (T3)、1.5 t·hm -2 (T4)和1 个完全空白对照(CK1：不施任何肥料和生物炭)，每个处理设3 次重复，随机区组排列。每个处理均常规施肥：其中烟草专用肥525 kg·hm -2 、芝麻饼肥675 kg·hm -2 、钙镁磷肥459 kg·hm -2 、氢氧化镁187.5 kg·hm -2 、硝酸钾345 kg·hm -2 和硫酸钾300 kg·hm -2 ，氮磷钾比例为 1:0.78:2.87。起垄前，所有物料于起垄前1d 条施，施用生物炭后，将其他物料混匀后撒施于生物炭上。植烟行距1.2 m，株距 0.5 m，试验地四周设保护行，田间栽培管理按当地优质烟叶生产技术规范进行。

1.3 土壤取样

在烟草移栽75 d 时，根据5 点取样法确定取样点，每个处理确定6 个取样点即每个重复设2 个取样点，用铲子将烟株周围的10 cm 的土壤挖至30 cm 的深度，切割土壤中烟株的任何侧根，挖出烟株整个根部。 将根球放入盆中，摇动根部用铲子从根部去除土壤，将采集盆中的土壤分成两部分，一部分将采集盆中无 碎块的土壤5~10 g，除植物根、动物残骸及其他杂质，混匀过2 mm 筛，保存在10 mL 无菌离心管中，用干冰保存送往上海欧易生物科技有限公司，对采集的土壤样品进行微生物多样性检测。另一部分将采集盆中的土壤放入密封袋中，常温避光条件下风干、磨细和过筛，进行土壤样品分析。

1.4 土壤理化性质及酶活性分析测定方法参照文献，有机质测定采用重铬酸钾氧化法;速效磷测定采用0.5 mol·L-1 NaHCO3浸提钼锑抗比色法；速效钾测定采用0.5 mol·L-1 NH4OAc 浸提-火焰光度法；pH 值测定采用 pH 酸度计，土壤酶活测定使用科铭生物公司提供的试剂盒，土壤物理特性使用土壤温湿度测量仪。1.5 土壤微生物测定分析方法

采用DNA 抽提试剂盒对样本的基因组DNA 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据测序区域的选择，用带有barcode 的特异引物扩增16S V3~V4区。引物序列为343F(5'- TACGGRAGGCAGCAG -3')和798R(5'- AGGGTATCTAATCCT-3')；Takara 公司的Takara Ex Taq 高保真酶进行PCR 扩增，确保扩增效率和准确性。PCR 产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR 模板，并进行二轮PCR 扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR 产物进行Qubit 定量。根据PCR 产物浓度进行等量混样，并上机测序。

使用Trimmomatic 软件对原始双端序列进行去杂。去杂参数为：检测并截去模糊碱基N；并采用滑窗法检查平均碱基质量，当质量低于20 时，截取前面高质序列。去杂后的双端序列利用 FLASH 软件进行。测序数据进行预处理生成优质序列之后，采用Vsearch 软件，根据序列的相似性，将序列归为多个 OTUs。 参数为序列相似度大于或等于97%被归为一个OTUs 单元。使用QIIME 软件包的挑选出各个OTUs 的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。

1.6 数据分析

采用Microsoft Excel 2016 分析数据，方差分析采用最小显著性差异(least significant difference)法用DPS7.0 软件分析处理数据，热图分析根据物种或样本间丰度的相似性进行聚类，用R 软件的vegan 包绘图。主成分分析(principal component analysis，PCA)采用SPSS11.0 软件。微生物使用的UPARSE 软件，根据97%的相似度对序列进行OTUs(operational taxonomic units)聚类；使用UCHIME 软件剔除嵌合体。利用 RDP classifie 对每条序列进行物种分类注释，比对 Silva 数据库(SSU123)，设置比对阈值为 70%。

2 结果与分析

2.1 生物炭对土壤养分及酶活的影响2.1.1 生物炭对土壤特性及基础养分影响

由表 1 能够看出，生物炭的施用能够显著改变根际土壤特性。从物理特性来看，与CK1 相比，CK2 会增加土壤容重，增幅为 9.56%；施加生物炭后土壤容重会较CK2 减少，较CK2 来说，4 个生物炭处理分别降低了14.76%、18.12%、24.83%和 26.17%。T3 和T4 处理的土壤容重较小，且与CK2 处理存在显著性差异。施加生物炭处理在土壤温湿度方面较与CK2 之间不存在显著性差异。施加生物炭能够轻度缓解土壤酸性，4 个生物炭处理的pH 值较CK1 分别增加了0.63%、6.17%、2.68%和 2.05%，除T1 处理外，其他3 个生物炭处理均与CK1、CK2 处理存在显著性差异。

由表2 能够看出，土壤速效磷含量以T2 处理最高，较CK2 来说增加了23.16%，土壤速效钾、有机质含量以T3 处理达到最高值，分别较CK2 增加了38.70%和14.16%。较CK2 来说，生物炭添加后土壤中的全氮含量没有太显著的变化，但是土壤全碳和全硫含量都有了显著的提升。由表2 可以看出，T4 处理的碳氮比最高，CK1、CK2、T1、T2 和T3 处理分别较T4 处理来说减少了18.71%、9.21%、5.52%、4.60%和2.07%。

2.1.2 生物炭对土壤酶活的影响

由图1 可以看出，随着生物炭添加量的增加4 个土壤酶活活力均呈现出先增加后减少的趋势。从图 1(a)来看，T3 处理的 INV 活力最高，CK1 处理INV 的活性较T3 处理来说降低了73.59%；从图 1(b)来 看，生物炭处理的URE 活性远远高于未施加生物炭处理的活性，生物炭处理中属T3 处理的URE 活性最高，较 T1、T2 和T4 处理的URE 活性来说分别提高了25.98%、12.52%和6.14%；从图 1(c)来看，CAT 在生物炭处理之间差异不大，但是与CK1、CK2 处理存在显著性差异。从图1(d)来看，以T3 处理NPH 活性最高，CK1 处理较T3 处理显著减少了 69.14%。

2.1.3 土壤特性与酶活的相关性

由图2 可以看出，NPH 与pH 值呈现正相关(P

2.2 生物炭对土壤细菌多样性及群落结构影响2.2.1 样本测序结果及土壤细菌群落的 α 多样性

试样共获得1433117 条有效序列，单样本平均序列数为39808 条有效序列。样品统一抽齐后检测到的OTUs 总数为11244，由图3 可以看出所有样本中共有的OTUs 总数为714，生物炭处理所特有的OTUs 总数分别为2513、2500、2408 和2576。

Simpson 指数和Shannon 指数用来评价细菌群落的多样性，Chao 指数用来反映细菌群落的丰富度，Coverage 指数反映细菌群落覆盖度。由表3 可以看出施用生物炭后Shannon 指数均大于CK1 和CK2 处理， 以T1 和T4 处理的增长较为明显；从 Chao 指数来看，生物炭处理与未施肥处理存在显著性差异，以T4 处理的增长最为明显，较CK1 处理来说增加了10.39%。试验样本测序覆盖度均达到94%以上，表明样品测序深度足够，完全满足后续数值分析。

2.2.2 生物炭对土壤细菌群落结构的影响

由图4 可以看出，变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度以T2 处理最高，相比较于CK1 处理明显提高了9.59%，T2 处理相比较于T1、T3 和T4 处理的相对丰度分别提高了4.44%、3.92%和6.66%；酸杆菌门 (Acidobacteria)的相对丰度大小为：T4>CK1>CK2>T1>T3>T2，CK2 处理较CK1 处理的相对丰度下 降了 4.99%，说明CK2 处理会使酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度下降；T2 处理较CK1 处理的相对丰度降低了25.12%，但是除T2 处理外，T1、T3 和T4 处理的相对丰度均高于CK2 处理且T4 处理还高于CK1 处理，说明高添加量生物炭能够改善未添加生物炭带来的酸杆菌门(Acidobacteria)的下降；芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes)的相对丰度以T3 处理最高，较 CK1 处理明显提高了39.66%，而CK2 处理较CK1处理仅提高了4.81%；各个处理放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度大小排列为：CK1>CK2>T1>T4>T3>T2，T2 处理较CK1 处理减少了16.38%。由图5 可知T1 处理和T3 处理最先聚在一起，之后再和T4处理聚在一起，CK1 处理与CK2 处理聚在一起。CK1 处理与绿弯菌门(Chloroflexi)处理呈现极强的正相关关系，与变形菌门(Proteobacteria)呈现负相关关系。T2 处理与酸杆菌门(Acidobacteria)呈现极强的负相关关系。

2.2.3 生物炭对土壤细菌群落主成分的影响

基于OTUs 丰度的土壤菌落结构主成分分析如图6 所示，PC1 轴和PC2 轴对样本组成差异的贡献值分别为6.84%和5.86%。由图6(a)可以看出各个样本的组内生物重复一般，CK1 处理与生物炭处理的距离较远，说明未施肥处理与生物炭处理土壤细菌群落组成结构存在差异。T3 处理与T4 处理样本点的距离较近，说明T3 处理与T4 处理的土壤细菌群落结构相似。T2、T3 和T4 处理各样本点随着生物炭的使用量的改变在PC1 轴上依次排开，说明生物炭处合对土壤微生物细菌群落结构有明显的影响。由图6(b)可以看出，T2 和CK1 处理各存在一个异常值，T2、T3 和T4 处理分别呈左偏态分布，T1、CK2 和CK1 处理分别 呈右偏分布。

2.3 土壤细菌多样性及群落与土壤酶活相关性分析2.3.1 细菌多样性指数与土壤酶活相关性分析

土壤细菌α 多样性由Shannon 指数和Chao 指数来反映，土壤细菌β 多样性由NMDS1 指数和NMDS2 指数来反映。由Heatmap 图分析来看，土壤细菌β 多样性与CAT 呈现正相关关系(P

2.3.2 土壤细菌群落结构与土壤酶活相关性分析

由表4 显示在门水平上相对丰度前15 名的细菌门类与土壤4 种酶活之间的相关关系。芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)及放线菌门(Actinobacteria)的丰度与4 种土壤酶活的相关性极好，芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes)的相对丰度与4 种土壤酶活均呈现极显著正相关关系(P

3 讨论

3.1 生物炭对土壤酶活的影响

生物炭因其自身特殊的理化性质，施入土壤后能够引起土壤理化性质的变化，且在一定程度上影响了土壤酶活性。生物炭的添加整体促进了INV、URE、CAT 和NPH 的的活性，且随着生物炭添加量的提升，土壤酶活的提升作用呈现先增加后减弱的趋势，均在生物炭用量为1.2t·hm-2(T3)时，各土壤酶活性达到最高值，与张继旭等的研究成果相印证。关荫松等的研究发现土壤中有机质的含量、微生物数量和呼吸强度均会影响INV 的活性，本研究中生物炭处理土壤有机质水平及微生物活性较高，故生物炭处理INV的活性明显提升。安韶山等的研究发现URE 活性依赖于有机质，它积极参与了有机质的转化分解过程，有机质含量提升 URE 活性会随之提升。本研究中因施加生物炭后根际土壤有机质含量明显提升，故生物炭处理URE 活性高。冯爱青等的研究发现在棕壤中添加秸秆黑炭对NPH 起到抑制作用，而本文则是生物炭土壤中的NPH 有显著提高。有研究发现虽然添加生物炭能吸附植物根系土壤中的反应底物使土壤酶活提高，但是也能够吸附土壤中的酶分子对酶促反应结合位点形成保护作用，因而抑制土壤酶活。由于不同原材料制成的生物炭其吸附性及结构都具有特异性，不同酶活性对生物炭添加的响应并非是单一不变的；且本文发现土壤酶活与土壤 C/N、SOM 和 TC 等存在显著相关关系，表明土壤酶活是由多因子协同作用的，故土壤酶活性的改变程度主要受其自身性质、生物炭性质及添加量和土壤性质的影响。

3.2 土壤细菌多样性及群落结构对生物炭施用后的响应

施用生物炭对土壤细菌群落结构和多样性具有一定的影响，能够提升土壤细菌群落的多样性及丰富度，这与前人的研究一致。随着生物炭施用量的增加，土壤细菌群落多样性及丰富的度增加幅度呈现先减少后增加的趋势，T3 处理的增幅最小而T4 处理增幅大大增加。这是由于生物炭的添加量的增加会促进某些类细菌增长的同时也会抑制一些细菌的生长，导致土壤细菌群落结构发生改变。其中生物炭处理提升了变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的丰度，有研究表明生物炭独特的结构能够为土壤细菌提供一个有利的繁殖场所，且含有丰富的营养物质，有利于细菌的生长和相对丰度的提升。 但是本研究发现生物炭施用后土壤中的放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度会有所减少，且随着生物炭添加量的增多，放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度先降低后升高。有研究表明低添加量生物炭可能会促进某类细菌的生长繁殖，消耗掉土壤中的碳或改变土壤的理化性质，从而不利于放线菌门(Actinobacteria)的生长繁殖；而当生物炭添加量逐渐增多时，土壤中的碳含量也会随之增加，因此会减缓对放线菌门(Actinobacteria)的抑制作用。酸杆菌门(Acidobacteria)多属于寡营养类群，土壤的富营养状态并不适合该类菌群的生长，生物炭添加后改善了土壤的养分状况，虽然未达到富营养状态，但是较未添加生物炭处理来说，土壤环境发生了改变，也抑制了该类细菌的生长。且酸杆菌门(Acidobacteria)属于嗜酸菌，其丰度随着pH 的升高而降低，文中发现随着生物炭添加量的增加，土壤的pH 呈现先升高后降低的趋势，因此酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度先降低后升高。本研究结果发现未施肥处理与生物炭处理在主成分分析的图上距离远，说明生物炭处理能够改变细菌群落结构，已有研究表明，土壤中添加生物炭后，细菌的群落组成会发生变化，与本研究结果相印证。但本研究结果也发现生物炭处理的某些点距离CK2 处理较近，张玉洁等的研究认为生物炭施入土壤后能够在一定程度上改善土壤的微生态环境，但是可能只有利于个别类群相对丰度的增加。说明生物炭处理只是引起少数菌群结构发生了变化，并未引起大幅度的变化，一定程度上维持了原有土壤细菌群落结构，这与乌英嗄的研究相印证。由本文可以看出，生物炭其独特的结构能够直接影响土壤的理化性质及养分含量，因此改变了细菌生存的土壤环境，从而影响细菌群落及多样性。

3.3 生物炭施用后土壤酶活与细菌群落的相关性

本研究结果显示 INV、URE、NPH 和 CAT 均与细菌群落丰富度(Chao 指数)存在显著正相关关系(P

3.4 生物炭调控根际土壤微生态机制分析

土壤酶活与土壤养分的相关性分析结果发现土壤碳氮比是影响 INV、URE、CAT 和NPH 活性的关键影响因子，同时土壤酶活又与细菌多样性存在显著正相关关系，因此本研究探索并推测生物炭对根际土壤微生态的调控机制，即含碳丰富且多孔的生物炭施入土壤后改变了土壤理化性质，土壤容重降低，pH 值、速效磷、速效钾、有机质含量和碳氮比均升高，改变了土壤细菌生存的土壤微生态环境，从而影响了土壤细菌的生长、发育和代谢。如芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度的增加及放线菌门(Actinobacteria)丰度的减少，本研究表明 INV、URE、CAT 和 NPH 活性与芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度呈现极显著的正相关关系，与放线菌门(Actinobacteria)丰度呈现极显著负相关关系，因此土壤某些细菌的改变增强了INV、URE、CAT 和 NPH 的活性。总的来说，生物炭的施用调节了土壤碳氮比调控了根际微生态环境和养分的协调，增加土壤微生物的多样性和改变菌群结构，促进土壤酶活性提高，增强了多酶体系的活性， 协同促进酶促反应，改善土壤微生态环境，其作用机制如图8 所示。

4 结论

生物炭能够显著提高4 种土壤酶活及土壤养分，且高添加量生物炭的作用大于低添加量生物炭。土壤养分及理化性质的改变，促进了根际土壤细菌群落的变化。生物炭作用过程中发现土壤碳氮比是影响土壤酶活性的关键因子之一，土壤酶活与芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)存在极显著正相关，与放线菌门 (Actinobacteria)存在极显著负相关关系(P- 2 的生物炭为较适宜的添加量。

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