【文献解读】发表 26分SCI有多难？生信方法无压力！|斯隆凯特琳|细胞|肿瘤细胞|蛋白|雄激素

今天分享一篇今年8月美国斯隆凯特琳癌症中心在《Cancer Cell》期刊上发表的文章：

Tumor Microenvironment-Derived NRG1 Promotes Antiandrogen Resistance in Prostate Cancer

IF=26.602（中科院一区SCI）

全文获取链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610820303093

关键词

激素治疗

肿瘤微环境

癌相关的成纤维细胞CAF

NRG1/neuregulin 1

抗药性

为什么要做这项研究

目前在治疗晚期前列腺癌上，患者对激素治疗的抗性仍然存在。美国斯隆凯特琳癌症中心课题组发现，与癌症相关的成纤维细胞（CAFs）可以促进小鼠和前列腺器官培养物的抗雄激素的抗性。他们在CAF上清液中鉴定了NRG1/neuregulin 1能通过激活 HER3 促进肿瘤细胞的耐药性。所以他们的这项工作揭示了前列腺癌中抗雄激素抗性的旁分泌分子机制。

这篇文章的最精彩亮点是什么

CAF-derived NRG1 confers antiandrogen resistance in prostate cancer.
Pharmacological blockade of the NRG1-HER3 axis induces tumor regression.
NRG1 is upregulated in prostate stroma in patients after androgen deprivation therapy.
High NRG1 activity and reduced sensitivity to second-generation antiandrogen therapy.

这篇文章做出了哪些结果

1.CAF促进了前列腺癌组织模型对抗雄激素的抗性

该美国课题组人员首先把人前列腺癌组织CWR22移植到小鼠身上，从而构建小鼠模型CWR22Pc，这个模型慢慢从去势敏感性演变为去势抵抗。接着，他们用一种特异性抗体与表面抗原相结合，通过流式细胞仪，单独从小鼠成纤维细胞中分别纯化出人癌上皮细胞22Pc-EP以及CWR22Pc相关的成纤维细胞22Pc-CAF。该课题组还发现，22Pc-EP细胞和CWR22Pc细胞相比较，22Pc-EP细胞对比卡鲁胺Bic出现抗性比CWR22Pc细胞要晚得多。但是22Pc-EP细胞对恩杂鲁胺Enz没有抗性，仍然继续生长；而CWR22Pc细胞对Enz具有抗性。因此，他们推测出CAFs可能有助于获得对抗雄激素具有抗性的状态。

2.CAF分泌的蛋白因子促进抗雄激素的抗性

该课题组推测，在抗雄激素治疗期间，CAFs对癌细胞生长的促进作用可能通过两种可能的机制发生：纤维细胞与上皮细胞间接触或CAFs衍生的可溶性因子的分泌。于是，他们从22Pc-CAF或22Pc-EP中收集培养液，测试它们促进22Pc-EP细胞生长的能力（22Pc-EP细胞经过雄激素阻断CSS处理）或抗雄激素(Bic或Enz)。他们发现22Pc-CAF促进了22PC-EP细胞对CSS的抗性，表明CAFs分泌的其中一种可溶性因子对生长有一定作用。另外，随着22Pc-CAF浓度加大两至四倍后，大大加快促进抗性的活性，这表明这具有剂量依赖效应。如果22Pc-CAF遇到95℃高温或蛋白酶K后，使之丧失了促进抗性的活性而恢复细胞生长，这也说明了一些可溶性因子是蛋白。22Pc-CAF也会促发前列腺癌对CSS和Enz的抗性。

接下来，该课题组继续深入探索22Pc-CAF的分泌性蛋白因子是否会重新激活22Pc-EP中的雄激素受体信号通路（在抗雄激素药物Enz的存在下）。他们观察到22Pc-EP细胞能持续性生长。所以，22Pc-CAF的分泌蛋白因子可通过一种机制（不立即引发AR激活的机制）促进22Pc-EP对抗雄激素的抗性。

3.分泌性CAF抗药活性与Neuregulin 1蛋白有关

该课题组人员为了鉴定出22Pc-CAF中关键性蛋白，采用生化分级分离方法分析了22Pc-EP细胞及其RTKs。RTKs激活可使前列腺发生癌变前的雄激素受体绕过肿瘤信号通路。然后对这些蛋白进行纯化。接下来，他们用小分子抑制剂HER2或FGFR处理22Pc-EP细胞。NRG1/neuregulin 1是HER3的主要配体。NRG1只存在于22Pc-CAF的活性Q亚组分中。之后，他们利用qRT-PCR检测Nrg1-4的mRNA表达量，发现了Nrg1在22Pc-CAF中大量表达出neuregulin。

该课题组还进行了RNA原位杂交，以确定Nrg1表达的小鼠细胞和ERBB3表达的肿瘤细胞之间的关系。同时用多种颜色的荧光素去显色，发现了Nrg1并没有结合在人ERBB3，说明肿瘤浸润CAF表达的NRG1通过旁分泌机制作用于癌细胞。

4.NRG1能激活一组雄激素受体的靶基因

该课题组在22Pc-EP细胞上做了转录组分析。对比NRG1与AR调控的转录组，显示有1917个共调控基因，并分成4大基因簇。第一个基因簇里的基因被Enz所抑制住，因而这些基因可能具有维持癌细胞活性的作用。

5.NRG1活性与CRPC患者的不良治疗结果有关

为了确定NRG1是否影响抗雄激素治疗的效果，该课题组利用最近发表的一组抗雄激素相关治疗效果数据的CRPC患者进行了基因组注释。在54个mCRPC患者队列里AR信号通路抑制剂ARSI的NRG1特征与治疗时间进行了Pearson相关分析。

美国斯隆凯特琳癌症中心的课题组在组织水平、细胞水平、分子水平、基因水平上都做了不少数据结果，只求成功验证一个大问题，所以能发表在如此高分的期刊。现在来看看他们总共用了哪些主要验证方法。

1. 构建动物模型（异种移植）、细胞系模型

2. 收集临床病人的样本（必须提前获得病人的知情同意哦）

3. 分离CAF细胞、细胞培养

4. 收集并检测条件培养液：抗雄激素分析试验、雄激素阻断分析试验、Enz或Bic试验、RTK信号通路试验、生长因子试验

5. 组织芯片

6. NRG1在临床样本上的免疫组化分析

7. CRISPR-Cas9法进行基因打靶

8. 逆转录病毒转导

9. Western blot

10. qRT-PCR检测基因表达

11. RNA测序

12. 生信分析：GO注释、GSEA分析

总体上说，这篇文章可以看到，非恶性基质细胞可以通过分泌HER3配体NRG1以旁分泌方式促进抗雄激素的抗性。手术切除前列腺癌组织前，通过雄激素阻断治疗后基质上表达的NRG1会增加，表明这可能会防止肿瘤细胞免受去势诱发的细胞死亡。在晚期患者中，Nrg1介导的HER3信号通路激活与第二阶段抗雄激素治疗的较短反应时间有关。所以，美国斯隆凯特琳癌症中心对此做的这项重大癌症研究，为了进一步优化对前列腺癌的抗雄激素治疗方案提供了理论依据。

能发表在高分期刊的文章，无非都有这两大特征：