2020 年，新冠病毒来袭。面对未知病毒爆发，我们如何迅速找到病毒与细胞结合的受体基因，从而争分夺秒地研究阻断药物？2020 年，癌症依然在威胁着人类健康，我们如何从基因治疗入手，寻找治愈癌症的方式？

疾病研究说来简单，只要找到目标基因，就能针对性地展开各项研究。可是，人全基因组包含 2 万多条基因，分别对每个基因去研究无异于大海捞针，怎么办？

有没有一种实验技术能够像「开挂」一样筛选候选基因呢？

有，CRISPR-SCREEN 技术。

今天的文章将为大家详细介绍一种专门用来大海捞针的技术—帮助更多的研究者了解这项技术，并用这项技术得到更好的研究成果。

CRISPR-SCREEN 简介

CRISPR-SCREEN 又称 sgRNA 文库筛选，或者高通量基因编辑技术。是一种由张锋团队开发的，基于 CRISPR-Cas9 系统，通过构建全基因组 sgRNA 文库同时对多个细胞的不同基因进行编辑，辅助以特定的筛选方案，通过 NGS 测序和生信分析的手段，筛选出符合条件的候选基因[1]。

CRISPR-SCREEN 筛选详细流程

进行 CRISPR-SCREEN 需要经过多个流程，详细的实验流程见下图：

CRISPR-SCREEN 全流程总览[3]

如何对全基因组或者部分基因组序列 sgRNA 文库序列设计呢？

要想用好 CRISPR-SCREEN 技术，sgRNA 文库的设计是非常重要的，设计的 sgRNA 既要编辑效率高，又要脱靶低，还要敲除后能保证基因发生移码突变，所以我们需要综合考虑多种条件，其中最重要的几个条件如下：

  • GC 含量分析；

  • 切割位置选择；

  • 序列二级结构分析；

  • gRNA 特异性分析；

  • 设计的 gRNA 序列（除 PAM）避免出现 4 个或者以上的 T 在靶序列中；

  • gRNA 序列预测的 efficient score；

  • gRNA 序列潜在的脱靶或者错配数。

如何构建高质量 sgRNA 文库？

高质量的 sgRNA 是结论准确的重要保证，那么如何构建高质量的 sgRNA 文库的呢？

▷首先，合成 sgRNA 文库芯片的正确率和覆盖度极其重要；例如：以长度为 100 nt 的 sgRNA 为例子，若 5‰ 平均突变率（为行业突变率均值），则 sgRNA 文库中完全正确的 sgRNA 数在总 sgRNA 的比例为：（0.995）^100 = 60.6%；若 1‰ 平均突变率（金唯智美国 chip-oligo 突变率），则 sgRNA 文库中完全正确 oligo 数在总 sgRNA 的比例为：（0.999）^100 = 90.5%；而引物的覆盖度影响：如果以人全基因组文库 12 万条为例，如果覆盖度为 99%，则会丢失 120 条 sgRNA; 那么这丢失的 120 条 sgRNA 在后续结果分析中就会对分析结果造成干扰；由此可见芯片合成的质粒对后续文库质粒的影响有多大。

▷其次，文库的深度对于下游筛选中低频 sgRNA 丢失影响巨大，sgRNA 合成过程中，由于 sgRNA 合成规模大，sgRNA 的分布符合泊松分布的，因此一定会有一些 sgRNA 是低频的，因此在文库构建过程中，一定要保证文库具有足够的深度才能防止低频 sgRNA 的丢失：菌落总数至少是 sgRNA 总条数的 300 倍以上，才能保证低频 sgRNA 丢失率尽可能的低。

▷再次，要经过严格的 NGS 测序分析检测文库的覆盖度和均一性；覆盖度越接近 100%，均一性越接近 1，则代表文库的质量越高；因此在正式进行下游实验之前，一定要保证文库通过 NGS 质检并达到相应的质量标准。

大规模细胞筛选前需要做好哪些准备呢？

大量的文库慢病毒制备以及 Cas9 稳定表达细胞系的构建有哪些注意事项呢？

▷首先，大规模筛选中需要的病毒总量预估：需要根据 sgRNA 文库的总条数，以及目的细胞系的慢病毒侵染 MOI 值，平行实验的数目，项目验证的时间节点的具体方案，来计算大规模实验中所需要的慢病毒总量；一般来说，如果文库 sgRNA 总条数多，需要设计多个平行实验和细胞收集节点，慢病毒侵染目的细胞的 MOI 值高，那么就需要非常大量的慢病毒并需要提前准备并做好验证；

▷其次，高表达 Cas9 的稳转细胞系也是后续细胞筛选实验及最终结果准确的重要保证之一；因此构建的 Cas9 稳定表达细胞系也需要通过基因组水平，mRNA 水平（qPCR 检测），蛋白水平（WB 检测）以及功能验证（基因编辑效率验证）等多个水平的检测。

大规模细胞筛选时又有哪些注意事项呢？

CRISPR-SCREEN 技术的核心就是筛选，大规模的筛选，理论上来说，越大的细胞 pool 筛选库得出的结论越接近真实情况；然而实际实验操作过程中，考虑到实验方案的可操作性，不可能无限制的增加筛选库，即使这样，为了包装结果的可信度，我们仍然对于实验参数设计有最低的限制。

▷首先，病毒侵染细胞时，单个细胞进入的病毒数目超过 2 个，则可能导致结果出现较差影响，因此最理想的状况是细胞中进入的病毒数量不超过 1 个，所以在病毒侵染细胞的过程中，加入病毒/细胞的比例越低越好，然而比例越低同样会使实验规模成倍的增加，所以，为了保证结果的准确性，加入病毒量的 MOI 值在 0.3~0.5 之间才能保证结果的准确度；如果文库较小可以适当降低 MOI 值，则会使结果更加准确。

▷其次，要设计好实验方案，确定最合适的阴性对照组，同时一般建议做 2~3 个平行实验组，以确保后续结果分析的准确性和实验的可重复性。

▷第三，每一步实验都必须要保证足够的库容量来保证低频 sgRNA 在整个实验过程中尽量不因为库容量低导致的丢失，那么在筛选过程中，首先要保证大规模实验过程中初始被病毒成功侵染的细胞是 sgRNA 总数目的 300 倍以上；同时最终进行 NGS 建库过程中，也要保证使用足量的基因组 DNA 建库和足够的测序深度（300x 以上）来保证整个数据的准确性。

▷第四，得到 NGS 数据以后，可以根据自身研究目的，可以对数据从多个方向进行分析，充分发掘尽可能多的结论；

文献推荐

为了让大家看看在各自研究领域，杰出科学家是如何利用 CRISPR-SCREEN 进行相关领域的研究，小编针对非常适合用 CRISPR-SCREEN 的几个研究领域，给大家推荐一些非常经典的研究文献供大家更有针对性的参考。

药物靶点确定与验证：

研究人员利用 CRISPR-Cas9 文库筛选人类黑色素瘤 A375 细胞中的 18,080 个基因进行筛选，最终发现 NF2、CUL3 等 4 个基因参与了黑色素瘤 A375 细胞中的耐药调节过程[4]。文献题目：Genome-scaleCRISPR-Cas9 knockout screening in human cells。

基因环路上下游调控机制分析：

科研人员利用 CRISPR-Cas9 文库对癌症细胞中关键的转录因子 p53 和 ERα 的增强子元件的 685 个基因位点进行筛查。通过 CRISPR-Cas9 文库筛选，共鉴定出 3 个增强元件与 ERα 的相关；3 个增强元件与 p53 功能相关联的 3 个增强子，其中 2 个增强元件与 p53 完全结合才能激活细胞衰老过程[5]。文献题目：Functionalgenetic screens for enhancer elements in the human genome usingCRISPR-Cas9。

代谢通路调节机制分析：

科研人员选择对番茄植株 GABA 代谢通路中多个关键基因进行基因编辑，筛选得到六种 GABA 突变体，其中四基因突变的 GABA-6 突变体叶子 GABA 含量与 WT 相比提高了 19 倍，这为 CRISPR-Cas9 多靶点敲除技术在植株代谢调控中的应用研究提供了参考[6]；文献题目：MultiplexedCRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acidlevels in Solanum lycopersicum。

Longnoncoding RNA 作用机制分析：

使用慢病毒 psgRNA 文库，对人源肝癌细胞系 Huh7.5OC 进行基因组的 700 个 lncRNA 和另外 5 种癌症细胞进行敲除实验，最终筛选到 51 个 lncRNA 基因能够促进或者抑制肿瘤的生长[7]。文献题目：Genome-scaledeletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guideRNA CRISPR-Cas9 library

病毒侵染宿主细胞的受体蛋白筛选：

科学家通过 CRISPR 全基因组筛选，成功发现并证实 LDLRAD3 蛋白是委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）进入动物和人类细胞的受体[8]；以及上期小编专门进行过的文献解读的一篇利用 CRISPR 全基因组筛选出冠状病毒侵入宿主细胞的受体蛋白以及与新冠病毒相关正相关和负相关的重要基因[2]；文献题目：LDLRAD3is a receptor for Venezuelan equine encephalitis virus。

小结

CRISPR-SCREEN 技术虽然好用，然而每个环节都有很多的细节需要注意，要想真正的做好还是非常不容易的。金唯智同时具有全基因组 sgRNA 设计平台；全基因组 sgRNA 合成平台；慢病毒包装及稳转细胞系构建平台；高通量测序+筛选分析平台；以及具有 Broad 研究所专利授权，具备专业服务资质，可以为客户解决 CRISPR-SCREEN 中的任意环节提供高质量的解决方案，也可以为客户提供高质量的一站式的解决方案；同时为了助力抗击新冠，金唯智也重磅推出了新冠相关假病毒的相关产品。详细的产品信息参见下方产品和促销介绍，或拨打免费热线电话获得专业解答。

▶ 服务热线：400-8100-669-8

▶ 邮件咨询：GW-EditGene@brooks.com

▶ 在线咨询：点击「阅读原文」，可直达官方商铺咨询

Table 1：金唯智全基因组敲除文库现货产品信息介绍

Table 2：相关产品促销活动

参考文献（上下滑动查看）：

[1]Konermann, Silvana, et al. "Genome-scale transcriptionalactivation by an engineered CRISPR-Cas9 complex." Nature 517.7536(2015): 583-588.

[2]Wei, Jin, et al. "Genome-wide CRISPR screens reveal host factorscritical for SARS-CoV-2 infection." Cell (2020).

[3]Hartenian E, Doench J G. Genetic screens and functional genomicsusing CRISPR/Cas9 technology[J]. Febs Journal, 2015,282(8):1383-1393.

[4]Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening inhuman cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7

[5]Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elementsin the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2):p. 192-8.

[6]Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolicengineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanumlycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017

[7]Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human longnon-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. NatBiotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.

[8]Ma, Hongming, et al. "LDLRAD3 is a receptor for Venezuelanequine encephalitis virus." Nature (2020): 1-7.

关于金唯智基因编辑平台

金唯智在全面的一二三代测序服务（读基因），和经验丰富的基因合成服务（写基因）基础上，隆重推出了 CRISPR 基因编辑服务（编基因），包括：高通量基因编辑一站式服务（CRISPR Screen），细胞基因编辑服务，长单链 DNA（ssDNA）合成服务，病毒包装服务，微生物基因编辑服务，SARS-CoV-2 假病毒等产品。金唯智具有全基因组 sgRNA 设计平台；全基因组 sgRNA 合成平台；慢病毒包装及稳转细胞系构建平台；高通量测序+筛选分析平台；为您解决 CRISPR-SCREEN 任一环节难题，提供高质量一站式解决方案。

注：金唯智提供的 CRISPR/Cas9 技术服务的授权来自 Broad 研究所。

关于金唯智

GENEWIZ（金唯智）成立于 1999 年，总部位于美国新泽西州，是专注于基因组研究和基因技术应用的生物高科技公司。金唯智在全球范围内为科学研究人员提供高通量测序、基因编辑、Sanger 测序、基因合成、引物合成、分子生物学服务及 GLP 标准规范服务。基于金唯智严谨的科学和卓越的服务，包括近 30 位诺贝尔奖获得者在内的众多科研工作者已成为金唯智的忠实客户，全球诸多知名跨国公司以及著名高等学府也把金唯智选为其战略合作伙伴和首选供应商。2018 年，金唯智正式加入 Brooks 集团，成为纳斯达克上市公司的一部分。

联系方式：

邮件：Enews.China@genewiz.com.cn

电话：400-8100-669

图文来源：金唯智生物科技

题图来源：站酷海洛