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撰文 | 木兰之枻

责编 | 兮

活细胞内的生物学事件呈现高度动态化的特征，因此其发生和持续时间也难以借助时钟系统进行计算。因此，开发活细胞内适用的类时钟系统对生物学研究有非常重要的意义。近年来，研究者正尝试利用DNA来进行数据存储 （ ）【1,2】，甚至开发出DNA显微镜用于生物分子的空间定位分析 （）【3】。DNA能否用来记录细胞内生物学事件的时间信息？目前还缺乏相关研究对此加以验证。

2021年2月3日，来自韩国延世大学医学院的Hyongbum Henry Kim实验室在Cell发表题为Recording of elapsed time and temporal information about biological events using Cas9的论文。文章借助于CRISPR-Cas9工具开发出一套可记录细胞内生物学事件发生及持续时间的“DNA时钟”系统，从而证实了利用DNA记录时间信息的可行性。

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理论而言，Cas9对目标位点的编辑效率与时间存在相关性。研究者推测，在保证Cas9蛋白和gRNA表达稳定的前提下，目标位点的完整性应当呈现出指数式衰减的特征。而后研究者利用Cas9定向整合的HEK293T细胞系和自我靶向的gRNA文库 （stgRNA文库） 系统证实了这一猜想。研究者又对目标序列的可测量时间窗口与序列完整性半衰期之间的关系进行分析。结果显示，现有体系下，可测量时间窗口的跨度为半衰期的1/10~5倍，其中在半衰期的1~2倍时准确度最高。此外，由于stgRNA文库对应着众多目标位点，因此在计算生物学事件的时间信息时，需要对各位点的估值进行综合评估。研究者经过多重计算模拟和系统分析后指出，各目标位点估算时间的四分位数净推荐值 （nps） 的加权平均值对时间信息的预测准确度最高。随后研究者还在各组重复样本中证实了上述系统的准确性和可重复性。综上可知，研究者构建出一套可记录测量细胞内时间信息的“DNA时钟”系统。

为提升“DNA时钟”系统的普适性，研究者从多个方面对其优化：文库体量和细胞数目两方面的研究指出，包含100~200条stgRNAs的文库以及数万细胞的体系便足以构建出高精度的“DNA时钟”系统用于半衰期和时间信息的记录和测算。研究还证实，除Cas9定向整合的HEK293T细胞系外，不同类型的细胞系以及不同启动子驱动的Cas9转基因细胞系同样可用于“DNA时钟”系统的构建；当然，使用不同类型的细胞系以及不同的Cas9转基因体系时，需要额外的“相对时间常数”对新的“DNA时钟”系统进行校正，方能正确记录和测算生物学事件的时间信息。

此外，可靠的时钟系统应尽可能的独立于外界环境以免受干扰。研究者指出，不同的微环境中，无论是体外的2D培养体系，还是体内的3D培养环境，“DNA时钟”系统均能保持较高的稳定性和准确度。研究者还证实，哪怕同时改变系统的细胞类型、微环境特征以及Cas9的启动子，“DNA时钟”系统依然保持着相对的稳定性和准确度。最后，研究者还在细胞系和小鼠模型中对“DNA时钟”系统的适用性进行验证：在细胞系水平上，“DNA时钟”能准确记录化合物刺激细胞的持续时间，且时间精度可达小时级。此外，“DNA时钟”还首次实现了细胞内生物学事件发生时间的准确测算。而在小鼠模型上，研究者同样证实，“DNA时钟”系统可以较准确的记录和测算小鼠体内炎症的持续时间，以及用于炎症诱导的脂多糖 （LPS） 的注射时间。

总体而言，本研究利用CRISPR-Cas9系统的基因编辑特性，成功的设计出一套具有广泛适用性的“DNA时钟”系统用于记录细胞内生物学事件的时间信息。这一研究首次将DNA用于时间信息的记录，实现了概念上的创新；且“DNA时钟”系统的出现对众多生物学事件的研究有巨大的推动意义。虽然现有的“DNA时钟”系统依然不甚完善，但其应用前景令人期待。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.014

制版人：十一

参考文献

1. Koch, J., Gantenbein, S., Masania, K. et al. A DNA-of-things storage architecture to create materials with embedded memory.Nat Biotechnol38, 39–43 (2020).

2. Erlich, Y. & Zielinski, D. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.Science355, 950-954 (2017)

3. Weinstein, J.A., Regev, A., and Zhang, F. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction.Cell178, 229–241.e16 (2019).