新冠病毒（SARS-CoV-2）和非典病毒（SARS-CoV）的核苷酸序列具有近80％同源性，均使用相同细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）进入靶细胞1, 2。但新发的SARS-CoV-2似乎具有更强的传染性。新冠病毒编码的刺突蛋白（S）在决定入胞、宿主嗜性、免疫原性和致病性等方面起着至关重要的作用。SARS-CoV-2刺突蛋白与其他蝙蝠来源的类SARS-CoV病毒的S蛋白之间存在一个显著差异，即在S1和S2亚基的切割位点交界处插入了多个碱基氨基酸（RRAR）3，在蛋白翻译后转运过程中可以被位于高尔基体的弗林酶（Furin）切割，可能预先激活S蛋白，降低SARS-CoV-2对位于细胞质膜上的蛋白酶如跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的依赖性，促进病毒的入胞4。研究表明多碱性氨基酸的插入可以促进细胞间的膜融合，表达缺失了“RRAR”氨基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白引发的细胞膜融合程度显著降低5, 6。也有研究发现，多碱性氨基酸的插入在发生切割后，会形成“RRAR”即所谓的C-end rule (CendR)，可以被Neuropilin-1(NRP1) 识别，有助于病毒的感染入侵7, 8。值得注意的是，S蛋白的S1和S2亚基切割位点附近的序列似乎是不稳的，在细胞培养和患者样品中均检测到了不同程度的缺失突发生9, 10, 11, 12。

冠状病毒的入胞通常有两种途径：病毒颗粒与质膜融合（早期入胞途径）和与内体融合（晚期入胞途径）13。相较于内体融合途径，病毒直接与细胞质膜融合通路更高效快捷。位于细胞质膜的TMPRSS2或者外源蛋白酶的存在如胰酶等，会触发质膜融合途径。否则，它将通入晚期途径内吞进入细胞。内体的低pH环境会激活组织蛋白酶L（CTSL），触发病毒囊膜与内体的膜融合从而释放病毒基因组。研究表明，在高表达TMPRSS2但低表达CTSL的Calu-3人肺细胞中，SARS-CoV更倾向于通过早期膜融合途径进入细胞14。针对新冠病毒S蛋白插入的多碱性氨基酸的功能是研究热点。此外，调控新冠病毒入侵途径相关的宿主因子鉴定发现也值得深入挖掘。

近日，复旦大学基础医学院张荣/袁正宏/蔡启良等在Nature Communications上发表了题为A genome-wide CRISPR screen identifies host factorsthat regulate SARS-CoV-2 entry的研究论文。该文在去年8月提交到预印版BioRxiv上，题为The S1/S2 boundary of SARS-CoV-2 spike proteinmodulates cell entry pathways and transmission。该研究发现新冠病毒S蛋白多碱性氨基酸的插入可以调控病毒的入胞途径，该位点的缺失驱使病毒入胞途径从膜融合向内体入胞的转变。同时，利用缺失突变株进行全基因组CRISPR筛选，鉴定发现一系列调控病毒内吞途径以及病毒受体ACE2细胞膜表达相关的宿主因子。该研究还在仓鼠模型中进一步揭示S蛋白碱性氨基酸的插入与病毒的传染性密切相关。

这项研究基于最开始的新冠病毒的分离与毒种准备过程的偶然发现。作者注意到，新冠病毒在无胰酶条件下经Vero E6细胞传代，S蛋白的多碱性氨基酸很快发生缺失，病毒感染性显著增强，但是在Calu-3细胞上的感染性却降低。通过使用特异性抑制TMPRSS2介导膜融合的药物Camostat）和抑制CTSL介导的内体入胞药物E-64d，研究揭示多碱性氨基酸的缺失促使病毒的入胞从质膜融合（如高表达TMPRSS2的Calu-3细胞）向内体入胞（如低表达TMPRSS2但高表达CTSL的Vero E6和A549细胞）途径转变（图1）。

图1：新冠病毒S蛋白多碱性氨基酸缺失改变病毒的入胞途径

为了深入揭示新冠病毒内体入胞途径的调控机制，作者利用获得的多碱性氨基酸缺失突变病毒在A549-ACE2细胞上进行全基因组CRISPR筛选，鉴定发现一系列与货物转运相关的复合体如Retromer、CCC、WASH、Arp2/3等，以及其它胆固醇转运相关基因如NPC1和NPC2等宿主因子（图2）。进一步验证显示，这些因子对经内体入胞的SARS-CoV-2缺失突变体至关重要，而对野生型病毒作用不明显，特别是敲除CTSL基因对野生型无影响。此外，研究还证明这些因子对SARS-CoV和MERS-CoV的入胞都至关重要，是一类冠状病毒通用的内体入胞途径相关的宿主因子。此外，该研究还发现一类可以调控ACE2的细胞膜定位表达的宿主因子。

图2：全基因组CRISPR筛选发现SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV通用的内体入胞相关宿主因子

为进一步的揭示S蛋白碱性氨基酸插入对病毒感染的影响，作者建立了新冠感染仓鼠模型（goldenSyrian hamster）。新冠病毒可以自然高效的通过呼吸道感染野生型仓鼠，是良好的小动物模型。作者系统的评价了碱性氨基酸的缺失在不同组织器官如鼻腔上皮、气管、肺、脑、心、肠、脾、肝、肾脏等的感染特性，结果显示缺失突变病毒在不同器官组织以及粪便中表现出较低的病毒载量和较轻病症。更重要的是，通过接触传染性试验证明，缺失突变病毒的传染性几乎丧失，在与感染仓鼠接触的仓鼠鼻腔上皮和肺组织中检测不到活病毒存在，这表明了S1/ S2附近的多碱基序列在传播中发挥的关键作用。这很大可能是由于野生型病毒使用了更有效的质膜融合入胞途径（图3）。

图3：新冠病毒S蛋白碱性氨基酸的插入与传染性相关

综上所述，该研究比较系统的揭示了新冠病毒S蛋白碱性氨基酸的插入对病毒入胞途径以及传染性的影响，并用S蛋白缺失突变病毒鉴定发现了一些列可调控病毒入胞的宿主基因，特别是调节内体入胞途径相关的基因（图4）。

我们知道，SARS-CoV刺突蛋白S1/S2附近并无碱性氨基酸的插入，这与SARS-CoV-2的碱性氨基酸缺失突变体类似，而在鼻和支气管组织中，决定膜融合入胞途径的蛋白酶TMPRSS2高表达15, 16, 17，这意味着相对于缺失多碱性氨基酸的病毒来说，野生型SARS-CoV-2有较强的经呼吸道飞沫传染特性，一定程度上解释了 SARS-CoV-2与SARS-CoV在传染性方面的差异。但从致病性角度看，SARS-CoV-2的致病性比SARS-CoV低，这可能与该病毒编码的其它病毒因子差异有关。

鉴于野生型新冠病毒S蛋白含有多碱性氨基酸插入，在表达TMPRSS2的鼻和支气管中倾向于通过质膜融合的入胞途径，因此，仅靶向内体入胞途径可能不是抑制SARS-CoV-2感染的有效策略。这也解释了针对病毒内体入胞途径的药物，如典型的溶酶体酸化抑制剂——氯喹或者羟氯喹，在临床上的表现不尽如人意的原因18, 19, 20。

Vero E6作为新冠病毒毒种准备的主要细胞，在无胰酶存在条件下，S蛋白的碱性氨基酸位点极易发生突变，并造成病毒感染特性的巨大差异。该研究也提示了新冠病毒毒种准备过程中监测该位点突变的重要性。此外，对于新冠病毒S蛋白该多碱性氨基酸位点的获取一直是个谜，也是争论焦点，该研究对探究病毒进化与跨物种传播提供了新的启示。

图4：新冠病毒S蛋白碱性氨基酸的插入调控病毒入胞途径及传染性

据悉，复旦大学上海医学院基础医学院病原生物系的朱云凯、冯飞、胡高维和王玉燕为该论文的共同第一作者，张荣、袁正宏和蔡启良为共同通讯作者。复旦大学的谢幼华、瞿涤、朱园飞等，清华大学的丁强、南方医科大学的徐伟等，以及复旦大学生物安全三级实验室为课题提供了大力支持。

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https://www.nature.com/articles/s41467-021-21213-4?utm_source=other&utm_medium=other&utm_content=null&utm_campaign=JRCN_1_LW01_CN_natureOA_article_paid_XMOL

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