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尽管自然界中的碳水化合物和糖复合物结构十分复杂，但人的糖蛋白和糖脂仅有九种构成单元：葡萄糖（glucose, Glc）、半乳糖（galactose, Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine, GlcNAc）、N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine, GalNAc）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid, GlcA）、木糖（xylose, Xyl）、甘露糖（mannose, Man）、岩藻糖（fucose, Fuc）和N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac）（如图1）[1]。这些构成单元必须被活化为糖核苷酸后，才能参与到不同糖链的构建中[2, 3]。
糖核苷酸在结构上可分为两类：核苷二磷酸（nucleoside diphosphate, NDP）糖和核苷一磷酸（nucleoside monophosphate, NMP）糖，其中NDP-糖最为常见。尿苷二磷酸（uridine diphosphate, UDP）单糖是最常见的NDP-糖供体，在多糖生物合成途径中，它们能够被糖基转移酶或者合酶转移到糖基受体上构建糖苷键。
天然和非天然UDP-糖都能够通过化学、酶法和化学酶法来合成[4-7]。虽然已有很多文献报道了天然UDP-糖的合成方法，但是目前针对非天然UDP-糖的合成和应用的探索还相对匮乏。这些非天然糖基供体有很大的应用前景，可作为酶底物用于功能性多糖和糖复合物的合成、酶抑制剂研究以及各种活性测试[4, 8]。因此，非天然糖核苷酸的合成在过去十年间一直都是研究热点。Wagner等人总结了从1999年到2009年NDP-糖、NMP-糖及其衍生物的化学合成进展[4]，Thorson等人在2011年发表的有关糖基化的文章中详细总结了糖核苷酸的酶促合成途径（尤其是包括端基异构激酶和焦磷酸化酶的合成方法）及其底物和酶催化的转化[9]。
这里，我们总结了非天然糖核苷酸，特别是尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine, UDP-GlcNAc）/尿苷二磷酸乙酰氨基半乳糖（uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine, UDP-GalNAc）类似物的化学法、酶促法和化学酶法制备方面的进展，及其在生理和药理学方面的生物技术应用。由于很难通过修饰天然糖核苷酸来获得非天然糖核苷酸[4]，目前研究中主要由“两步法”合成策略来实现非天然糖基供体的合成：第一步是糖-1-磷酸（sugar-1-P）的合成，可以在此阶段实现结构的衍生化；第二步是二磷酸键的形成。同时，我们也介绍了糖核苷酸在过去十年中的新应用，包括碳链长度可控多糖的合成，稳定的同位素标记技术，酶促和代谢生物正交策略以及结构-活性关系（structure activity relationships, SAR）研究等。
图1.常见糖核苷酸
1 糖核苷酸的合成
常见的糖核苷酸中的大多数共有相似的生物合成途径，即由6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖作为关键中间体，以激酶和核苷酸转移酶作为关键酶。GlcNAc和GalNAc是很多重要多糖或糖复合物（比如糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs））的基本构成单元，所以对它们相应的核苷酸供体（即UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc）的研究最为广泛 [10,11] 。在生物合成途径中，通常是由酶催化葡萄糖（de novo pathway）或GlcNAc/GalNAc（salvage pathways）生成糖环1-位单磷酸化的中间产物GlcNAc-1-磷酸（GlcNAc-1-P），再对GlcNAc-1-P进行酶促焦磷酸化从而合成二磷酸供体UDP-GlcNAc [12] 。UDP-GlcNAc/GalNAc的生物合成也可被进一步简化：用6-激酶将糖转化为的糖-6-P，糖-6-P再经变位酶转化为糖-1-P，糖-1-P紧接着被尿苷三磷酸（UTP）焦磷酸化得到UDP-糖（如图2） [5] 。
图2.UDP-GlcNAc/GalNAc的生物合成途径
根据生物合成途径得知，核苷二磷酸糖合成的关键步骤是在核苷的5'-OH位和糖的异头羟基之间引入焦磷酸基团（如图3）[4]。目前研究中常用两种途径进行合成，第一种方法是将含离去基团的糖基供体（如卤化物）和核苷5'-二磷酸直接进行糖基化（如图3，path A）。但这种方法较难控制糖苷键的立体选择性。第二种方法是Khorana和Moffat开发的，目前更流行（如图3，path B）：耦合单糖-1-磷酸和活化的核苷5'-单磷酸盐（如核苷磷酸吗啡酸盐）来构建焦磷酸键，最终产物的糖苷键构型可以通过糖-1-磷酸的立体选择性来控制[13,14]。
图3.UDP-糖的一般合成途径
1.1 α-连接构型的糖-1-磷酸的合成
一般而言，控制糖-1-P的立体构型，再将其与活化的核苷5'-单磷酸酯偶联，可以控制UDP-糖基供体糖环和焦磷酸部分之间的糖苷键构型。到目前为止，对α-连接构型的糖-1-磷酸的合成方法的研究较为深入。
1.1.1 麦克唐纳反应（MacDonald reaction）
麦克唐纳反应是一种用于糖的单磷酸化的经典方法，反应过程是全乙酰基保护的单糖与磷酸在真空下进行的化学反应，以高选择性生成α-连接构型的糖-1-磷酸[15]。在这个反应的基础上，Masuko等人以30%-50%的产率构建了一个小型非天然GlcNAc-1-P和GlcNAc-1-P衍生物库（如图4）[16]。他们也证实了叠氮基和炔基在这种酸性条件下较稳定，因此，可以进一步通过点击化学反应进行荧光基团标记。
UDP-三氟乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNTFA）是在化学酶法合成硫酸乙酰肝素和肝素中一种常用的糖基供体，而在麦克唐纳反应的条件下三氟乙酰氨基也很稳定，所以也可以利用该反应合成α-连接构型GlcNTFA-1-P[17]。该方法也可用于其他糖核苷酸的合成，如α-D-阿拉伯呋喃糖-1-磷酸（α-D-arabinofuranose-1-phosphate, Ara-1-P）[18]、3-脱氧-α-D-阿拉伯己糖-1-磷酸[19]和2-脱氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸[19]。然而，麦克唐纳反应的反应条件较为苛刻，一般不适用于热稳定性差的糖的合成，而且其产率普遍偏低，这限制了该方法进一步的应用[4]。
图4.通过麦克唐纳反应合成GlcNAc/GalNAc-1-磷酸类似物
1.1.2 对半缩醛羟基进行磷酸化反应
对糖环半缩醛羟基C-1-OH直接进行磷酸化是另一种构建α-构型糖-1-P的有效方法。半缩醛羟基和磷酸化试剂反应后能获得保护基保护的α-构型单磷酸，然后经过催化加氢即可将磷酸盐上的保护基团去除，获得α-连接构型糖-1-P。Sabesan和Neira等人通过4-二甲基氨基吡啶（ 4-dimethylaminopyridine , DMAP）催化糖半缩醛和二苯基膦酰氯耦合构建了α-糖苷键[20]。Dinev等人用同样方法制备了13C标记的全乙酰化葡萄糖-1-磷酸，其产率为83%(如图5-I)[21]。Schultz等人在二异丙基氨基锂（lithium diisopropylamide, LDA）存在下用四苄基焦磷酸进行磷酸化，生成了高α-选择性的磷酸化产物（如图5-II）[22,23]。他们发现氟、叠氮基在这种条件下也很稳定，从而可以构建氟、叠氮基修饰的非天然糖基供体。Feng等人（如图5-III）通过三氮唑催化二苄基二乙基胺基膦（dibenzyl N,N-diethylphosphoramidite, DDP）与半缩醛，生成亚磷酸盐，随后氧化得到糖-1-P。虽然此反应没有立体选择性，产物为α，β混合物（α:β=1:1）[24]，但后续在四氢呋喃中用叔丁基过氧化氢（t-BuOOH）处理这两种异构体时，β-构型的产物能快速异构化为α-异构体。但是，在选择氧化剂时，如果使用过氧化氢（H2O2），会破坏O-P键生成副产物。同样，Graziani等用双（苄氧基）-N，N-二异丙基氨基-磷化氢/1H-四唑成功合成了GDP-D-甘油-α-D-甘露庚糖，然后用叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide, TBHP）氧化制备了关键的中间体α-磷酸盐[25]。该方法还可用于合成一系列糖-1-磷酸酯，例如D-甘露糖醛酸（D-mannuronic acid, ManA）-1-P[26]，N-乙酰基尿酸（N-acetylmuramic acid， MurNAc）-1-P[27]，2-脱氧-α-D-葡萄糖-1-P，3-脱氧-α-D-阿拉伯己糖-1-P, α-D-来苏糖-1-P和4-脱氧-α-D-lyxo-hexose-1-P[19]。
图5.糖半缩醛和磷酸化试剂间的缩合生成α-连接异头磷酸盐
1.1.3 酶法途径
由于糖核苷酸在有机溶剂中的溶解度较低，且糖苷键和焦磷酸键不耐水解，通过传统化学方法合成糖核苷酸非常具有挑战性。另外，在化学合成过程中通常涉及多步的保护基操作和异构体分离纯化，其过程繁琐、产率低下。而酶法合成利用了酶催化的高效选择性，能够模拟糖苷键生物合成途径，具有高立体选择性和高区域选择性，有广泛的应用前景[5]。
NahK （N-acetylhexosamine kinase）是一种N-乙酰己糖胺激酶，也是第一个被报道的野生型葡萄糖型1-激酶，可以快速有效地催化GlcNAc受体和5'-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）磷酸供体合成GlcNAc-1-P[28]。Zhao和Cai等人利用这种酶成功将非天然的GlcNAc/GalNAc类似物转换成了它们的1-磷酸化产物。并且他们发现这种酶的底物适用性非常好，无论糖环的C-4位羟基是平伏键或竖立键，都不影响酶对底物的识别（如图6）[29,30]。更重要的是，对糖底物的N-酰基进行多种正交基团的修饰，也不影响酶的识别。因此，通过此方法可以成功将一些正交基团标记到糖或糖复合物结构中去，便于进一步进行生物活性研究。另外，NahK可以与其他两种酶（Pasteurella multocida N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferasepm, PmGlmU和Pasteurella multocida inorganic pyrophosphatase, PmPpA）结合使用，从而“一锅法”合成UDP糖衍生物，大大简化了合成过程[31]。
图6.用NahK酶法合成GlcNAc/GalNAc-1-P衍生物
1.2β-键构型的糖-1-磷酸的合成
由于糖环端基的异构效应，相比α-构型，β-构型的吡喃糖磷酸很不稳定，所以其合成颇具挑战性。前面介绍的方法都无法实现β-构型的构建，目前也很少有文献报导β-键构型的糖-1-磷酸的合成。Oberthür等人利用α-构型糖基卤化物和四丁胺盐之间的SN2取代反应合成了β-构型2-脱氧糖磷酸(如图7-I)[32]。他们发现，更稳定的异头离去基团有助于磷酸化反应从SN1转换为SN2路径。同时，邻近基团的参与有助于磷酸化步骤中的立体控制。Timmons等人通过乙酰基或苯甲酰基保护的糖基溴化物和磷酸二苄酯的偶联，成功合成了β-L-岩藻糖/鼠李糖-1-磷酸(如图7-II)[33]。
图7.化学合成β-连接的糖-1-P
Prihar等人用邻亚苯基氯膦酸将甘露吡喃糖的半缩醛羟基磷酸化，得到β-D-甘露吡喃糖基-1-P[34]。同时，他们还使用MacDonald反应获得了β-和α-L-岩藻呋喃糖-1-磷酸的混合物（β:α=12:5）[35]。此外，酶促途径也可以实现β-构型糖-1-P的合成，如Stiller等人使用岩藻糖激酶合成了β-L-岩藻糖-1-P[36]。
1.3二磷酸键的构建1.3.1 化学法
在化学法构建二磷酸键过程中，使用催化剂或各种活性核苷磷酸吗啡啉酸酯，可以改善从糖-1-P转化为UDP糖的反应时间和收率。例如，磷酸和尿苷-单磷酸吗啡啉盐在吡啶中的偶联效率很有限[25]，引入催化剂1H-四唑后则能显著加快反应效率(如图8-I)，而uridine 5′-monophosphomorpholidate 4-morpholine-N,N-dicyclohexylcarboxamidine salt是在生产UDP-糖过程中最常见的活性单磷酸吗啡啉盐试剂[22]。此外，一锅法也能有效提高得率，Gold等人基于糖磷酸盐和核苷亚磷酰胺的耦合，同步原位完成了活化、氧化和去保护，快速合成了UDP-N-乙酰氨基己糖衍生物。其中，中间产物中的亚磷酸基团可直接被t-BuOOH氧化成磷酸基，从而生成目标供体(如图8-II)[37]。除了UDP-GlcNAc /GalNAc外，化学途径还可以实现其他糖核苷酸的合成，如UDP-4-脱氧-α-D-木糖吡喃糖（UDP-D-Glc）[38]、UDP-N-乙酰胞壁酸[27]、UDP-D-岩藻糖[39]以及GDP-D-ManA[26]。
图8.用化学方法合成二磷酸盐
1.3.2 酶法和化学酶法
焦磷酸化酶通常用于连接一个糖基磷酸和一个核苷单磷酸形成 UDP糖。例如，GlcNAc-1-P双转移酶（GlcNAc-1-P uridyltranferase, GlmU）能够催化糖-1-P和UTP反应来合成非天然UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc糖基供体[40]。同时，在催化过程中加入酵母无机焦磷酸酶可以降解副产物焦磷酸盐（PPi），推动反应向有利方向进行（如图9-I）[41]。Guan等人结合化学和酶法合成了一系列非天然UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc类似物，这些衍生物含有多种可以进行生物正交反应的官能团，所以可用多种生物正交反应来方便地修饰基团（特别是对C-2-氮-位上的官能团的修饰），组成非天然核苷酸糖数据库（如图9-I）[41]。虽然底物中C-2-氮-位上的酰胺键是被GlmU识别的必须基团[16]，但Guan等人发现修饰糖环的N-乙酰基、C-3、C-4、C-6等位置后，糖环仍然可以被GlmU识别，从而生成非天然糖基供体。并且，当C4位取代基更小时，酶催化效率更高[41]。
因为GlcNAc/GalNAc的C-4位羟基活性较低，所以可以首先选择性保护其他邻近位点的羟基，进而能够对C-4位进行修饰，合成非天然GlcNAc/GalNAc衍生物[42]。据此，Zhang和Schultz等人研究了C-4位的非天然修饰(如图9-II)[22, 23]。他们发现4-OH基团上的修饰不影响GlmU的识别，故合成了4F GlcNAc-1-P和4F GalNAc-1-P，随后这两种非天然糖-1-P成功地在GlmU催化下与UTP反应构建了二磷酸键。这种构建二磷酸键的方法的得率很高，与化学合成的方法收率接近，远超过利用大肠杆菌JM109菌株（E. coli JM109）的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的合成方法[24]。但是，研究人员也发现，GlmU不能识别4N3 N-乙酰氨基己糖-1-磷酸，其原因可能是叠氮基较大。
图9.直Panel (I)是GlmU催化焦磷酸化的机制，其中，X基团是甲基、乙基或者他们的叠氮基衍生物，Y基团是氢或者羟基；Panel (II)GlmU催化非天然4F UDP-GlcNAc/GalNAc的合成。
GlmU只能以糖-1-P为底物构建二磷酸键，而在酶法合成的实际应用中，一锅法能够以普通单糖为原料，通过多种酶联合催化合成UDP-糖，有时也会引入糖基转移酶或合酶，将UDP-糖直接聚合成寡糖或多糖。这种一锅法能够省去中间产物的提取、分离和纯化，提高合成的效率和得率，同时，也能以便宜的单糖而非较贵的UDP-糖为原料，节约了经济成本。例如，Chen等人开发了一种一锅多酶（one-pot multienzyme, OPME）策略，其中包含NahK_ATCC55813, PmGlmU和 PmHS2 （Pasteurella multocida heparosan synthase 2）三种酶，该策略能够以非天然糖基供体为原料，合成UDP-糖并原位进行糖基化获得二糖衍生物（如图10-I）[31]。Li等人用类似的合成策略，将两种单糖起始物分别经酶促途径合成相应UDP-糖后，在PmHAS （ Pasteurella multocida hyaluronan synthase）的催化下原位聚合成了均一的透明质酸（HA）（如图10-II）[43]。
同时，这种策略也可以用来制备其他糖核苷酸。例如，Wang等人报道了使用来自肠沙门氏菌的重组GDP-甘露糖焦磷酸化酶由Man-1-P合成GDP-Man[44]。随后，他们用相应的焦磷酸化酶合成了GDP-岩藻糖、UDP-木糖和UDP-阿拉伯糖[29]。不同于UDP-糖，CMP-Neu5Ac及其类似物可以直接从Neu5Ac获取，不需要通过N-酰基神经氨酸胞嘧啶转移酶催化获得糖-1-磷酸中间体[45]。
图10.一锅多酶策略合成肝素寡糖(I)或HA多聚物(II)
2 尿苷二磷酸糖基供体的应用
2.1 控制多糖/寡糖的合成
除HA来源于微生物外，目前商品化GAGs均是从动物中提取的。而生物体内合成的GAGs链长不均一、修饰基团多样，这导致其商品化产品是分子大小十分分散的复杂混合物[10]。 UDP- 糖能通过糖基转移酶的糖基化反应转移到碳水化合物的非还原端，若对这些UDP部分进行化学修饰，就可以实现对目标碳水化合物的可控合成以及功能化修饰。Schultz等人合成了一种可被糖基转移酶 PmHS1 (Pasteurella multocida heparosan synthase-1) 识别的4F UDP-GlcNAc供体[23]，这种非天然供体可作为糖链终止物[46]，从而可以制备序列长度可控的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）/肝素（heparin, HP）寡糖（如图11-I）。此外，氟可作为核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）分析的有效探针，所以酶促合成掺入的氟化糖可以促进多糖结构的表征[47]。
图11.Panel I是将非天然UDP-糖在GAGs合成中的应用，来源于参考文献[23]，版权归2017 AmericanChemical Society所有；Panel II是UDP-GlcNTFA在化学酶法合成肝素寡糖中的应用。
N-位三氟乙酰基修饰的UDP-GlcNTFA是一种能很好地被PmHS2识别的底物，能够用来以较高的产率用来延长HS主链[17, 48]。而产物上的三氟乙酰基团可在温和的碱性条件下去除，随后引入N-硫基团后即可以获得 GlcNS （N-sulfated glucosamine, C-2-N位硫酸化的氨基己糖）（如图11-II）[49, 50]。Zhang和Xu等人利用这种策略实现了GlcNS残基的区域选择性合成，并成功获得了一系列低分子质量肝素（LMWHs）和超低分子质量肝素（ULMWHs）[48, 51]。同样地，该策略也可以用于制备结构明确的HS多糖，并将其进一步用于纤维原细胞生长因子FGF1和FGF2信号传导的结构-活性研究。此外，Chen和DeAngelis合成了硫酸化的UDP糖衍生物，例如UDP-6-SO3-GlcNAc，证明该策略能将硫酸盐基团直接引入糖链。不同于将糖基供体转移到糖基受体的典型酶促糖基化，Li等人发现了一种新的甘露糖基-1-磷酸转移酶，该酶可以将甘露糖-α1-磷酸从GDP-Man转移到二糖受体上，获得甘露糖-α1-磷酸-6-葡萄糖键。
2.2酶抑制剂抗癌药物
目前有研究表明细胞表面多糖能调节癌症的增殖、入侵、分化、转移等[52]。也有研究表明在不同癌症细胞的增殖和转移过程中，高支链N-多糖的表达有显著提高。因此，以这些高支链多糖生物合成酶为靶标开发的抑制剂非常有潜力成为治疗癌症的新候选药物。研究人员也发现，增加细胞内UDP-GlcNAc的浓度后，此类糖蛋白受体的N-聚糖的分支会增加[53]，与细胞表面半乳糖凝集素3（一种形成晶格的凝集素）的亲和力也会有所增强[54, 55]，因此可以用于半乳糖凝集素3抑制剂的开发。
Nishimura等人合成了一些C-4位为氟原子的GlcNAc类似物[56]。他们发现从外源添加的这些衍生物能够穿透质膜进入细胞，并在PC-3细胞中转换成4F UDP-GlcNAc。随后，他们证实了非天然UDP供体能干扰天然UDP-GlcNAc的氨基己糖的生物合成途径，从而抑制超支化N-聚糖在人前列腺癌PC-3细胞中的表达。这为开发一组新的抗前列腺癌药物提供了新的思路。
2.3同位素标记策略
稳定同位素标记（stable isotope labeling, SIL）是研究生物大分子在代谢途径中的作用并追踪其利用率的最有前景的途径之一，在质谱分析中这些稳定的富含同位素的生物大分子类似物与它们的内源性类似物很容易区分[57]。Zhang等人通过化学酶法途径，用13C标记的UDP-GlcA成功合成了含13C标记的肝素九糖（如图12）[58]。随后他们将所得到的13C标记的化合物注射到脓毒症和非脓毒症小鼠体内，发现脓毒症小鼠中的硫酸乙酰肝素会通过血液循环渗透到海马区，导致认知能力的损坏[59]。通过非天然UDP-糖在多糖和糖复合物中引入同位素标记为探索其在生物体内的代谢机制、研究多糖药物的药效动力学以及新药的开发提供了坚实的基础。
图12.通过13C标记肝素九糖研究脓毒症，来源于参考文献[58]，版权归2019 PNAS所有。
2.4生物正交法
生物正交反应是在不影响机体正常生理和生化过程的条件下，能在生物体内发生的一系列高效、高特异性化学反应的总称[60, 61]，近些年来成为了聚糖分析中的一种有力工具[62]。
2.4.1 酶法生物正交标记策略
携带生物正交官能团（如叠氮基、乙酰基等）的非天然UDP-糖类似物能够经酶促反应转移到聚糖中，随后非天然聚糖能够与细胞、组织裂解物或者活体生物中的靶标物以稳定的共价键结合，实现目标糖复合物的标记、成像、检测和示踪[22]。例如，叠氮基对生物系统中的自然反应是惰性的，所以可以在不影响正常生物过程的条件下，通过叠氮基特异性反应（如与膦类化合物的施陶丁格反应[63, 64]和与炔烃的[3+2]环加成[65, 66]），用成像探针或抗原对目标物进行共价标记。
非天然UDP-糖通过生物正交反应不仅能实现多糖和糖复合物的荧光标记，还能够高选择性标记细胞表面抗原。Wen等人最近合成了一系列包含多种修饰基团的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc，构成了非天然UDP-糖的大型数据库[67]，这些基团能够参与很多生物正交反应，如点击化学（click chemistry）[65]、施陶丁格-贝尔托西反应（Staudinger-Bertozzi ligation）[68]（酮基）、迪尔斯-阿尔德反应（Diels-Alder reaction）[69]（乙酰基）、一步标记策略[70]（生物素基团）、拉曼追踪策略（Raman reporter strategy）[71]（腈基）和光活化交联[72]（重氮甲烷）。其中一些UDP-糖衍生物的活性甚至比它们的天然底物还要好。随后，研究人员们利用酶促生物正交反应成功地将叠氮基修饰的非天然UDP-GlcNAc/GlcNAc和几种已知的聚糖抗原（如在正常细胞中不表达但在癌症细胞中高效表达的O-聚糖Tn抗原和T抗原）结合，实现了聚糖抗原的标记(如图13)。这证明了一些UDP-糖类似物能够作为聚糖抗原的通用标记，为免疫疗法和临床诊断的发展提供了一种新的方向。
图13.用UDP-GlcNAz和UDP-GalNAz对Tn抗原、T抗原、Neu5Acα2,3-Gal、Fuca1,2-Gal和O-GlcNAc的酶促生物正交标记，来源于参考文献[67]，版权归2018 American Chemical Society所有。
2.4.2 代谢生物正交标记策略
非天然UDP-糖除了能通过糖基转移酶实现酶法生物正交标记外，还能够在体内经生物代谢途径并入到聚糖中，这也是聚糖成像和功能研究的一种有效方法[73-75]。然而在过去几十年中，这种策略仅应用在动物中。Zhu等人制作了研究植物聚糖的生物合成和生物学功能的探针，并在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中实现了蛋白N-聚糖的代谢标记和成像（如图14）[76]。利用代谢途径，他们将人工合成的Ac4GlcNAz转入植物中，随后通过生物正交反应引入了荧光基团，实现了对根组织中新合成的N-聚糖的可视化观测。同时，这种策略也能够实现拟南芥幼苗中蛋白N-连接的糖基化的成像，且成像结果具有空间和时间分辨率。这些代谢化学追踪（Metabolic chemical tracings, MCRs）虽然能够很好地用于糖蛋白的识别，但是他们也有一些局限性，比如无法进行选择性修饰且大多数MCRs对同一类糖蛋白没有选择性[77]。此外，在唾液酸的非天然9-叠氮基类似物的代谢引入的基础上，他们利用该策略实现了细胞表面唾液聚糖的荧光成像和唾液酸糖蛋白的蛋白质组分析。Baskin等人利用6-炔基-UDP-Gal和单击化学标记，成功地观察到了斑马鱼发育过程中胚胎和幼虫的糖基化作用。
图14.用Ac4GlcNAz代谢生物正交标记拟南芥N-连接聚糖：Panel I是在将拟南芥籽苗在含Ac4GlcNAz的液体介质中生长，通过GlcNAc补救途径将Ac4GlcNAz并入N-连接聚糖；Panel II展示了外源Ac4GlcNAz转换成UDP-GlcNAz的过程，来源于参考文献[76]，版权归2016 JohnWiley & Sons, Inc所有。
2.5 天然产物的糖基化
糖基化是一种常见的可以通过化学合成或酶促途径来实现的修饰天然化合物结构的手段，能增强天然产物的溶解度和稳定性。此外，由于糖在细胞分子识别中承担着重要角色，糖基化也能够改善一些抗生素的生物活性和稳定性[78]。因此，糖基化在药物改性和新药开发中有很大的应用前景，而UDP-糖基供体是酶促糖基化途径中重要的酶识别底物。
天然类黄酮是一种多酚结构化合物，广泛存在于食品中，在预防和管理诸如癌症、糖尿病和心血管疾病等慢性疾病中起着关键作用[79]。但天然类黄酮在水中的溶解度较低，而糖基化处理能改善其溶解度和生物活性。Chen等人在芒果（Mangifera indica）中发现了一种能催化双糖基化的C-糖基转移酶（Mangifera indica C-Glycosyltransferase, MiCGTb），并利用它催化UDP-α-D-葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-α-D-半乳糖或UDP-β-L-阿拉伯糖合成了含两个相同或不同糖单元的双-C-糖苷黄酮（如图15）[80]。但是，如果想要获得结构更加多样的双-C-糖苷，必须对C-糖基转移酶进行更为深入的研究来扩大其对供体和受体的识别范围。
图15.C-糖基转移酶催化的一系列糖-核苷酸对天然和非天然黄酮的C-糖基化，来源于参考文献[80]，版权归2018 AmericanChemical Society所有。
3 结论与展望
UDP-糖是碳水化合物的代谢和糖复合物的生物合成中一种非常重要的中间物，通过化学修饰UDP-糖能够控制目标碳水化合物或糖复合物的精细结构，从而使其获得不同的功能。在多糖/寡糖的合成中，非天然GlcNAc类似物取代天然GlcNAc可合成结构可控、均一性良好的目标产物。同时，非天然UDP-糖能够参与到多种生物进程中，从而作为一种有效工具来研究糖复合物生物合成途径、开发酶抑制剂。此外，糖基化与细胞分化和疾病发展过程息息相关，通过非天然糖核苷酸供体引入的标记有助于疾病发展规律的探索、天然药物的改性及新药物的开发。因此，开发非天然糖核苷酸的高效制备方法对合成、生物化学和药效动力学的发展都非常重要。
化学方法合成糖核苷酸反应步骤多、总产率低，难以进行工业化应用。酶催化具有良好的立体选择性和区域选择性，但纯酶促合成具有一些局限性，例如酶的稳定性差、底物适用性有限等。因此，兼具将化学衍生化的灵活性与酶催化反应的特异性的化学酶法合成策略是糖核苷酸合成过程中问题的一种非常有前景的策略。
参考文献：
1.Werz D B, RanzingerR, Herget S, et al. Exploring the structural diversity of mammalian carbohydrates ("Glycospace") by statistical databank analysis[J]. ACSChem. Biol.,2007, 2(10): 685-691.
2.van Heijenoort J. Formation of the glycan chains in the synthesis of bacterial peptidoglycan[J]. Glycobiology,2001, 11(3): 25R-36R.
3.Vocadlo D J, Hang H C, Kim E J, et al. A chemical approach for identifying O-GlcNAc-modified proteins in cells[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,2003, 100(16): 9116-9121.
4.Wagner G K, Pesnot T, Field R A. A survey of chemical methods for sugar-nucleotide synthesis[J]. Nat. Prod. Rep.,2009, 26(9): 1172-1194.
5.CaiL. Recent Progress in Enzymatic Synthesis of Sugar Nucleotides[J]. J. Carbohydr. Chem.,2012, 31(7): 535-552.
6.Bulter T, Elling L. Enzymatic synthesis of nucleotide sugars[J]. Glycoconjugate journal,1999, 16(2): 147-59.
7.Roy B, Depaix A, Perigaud C, et al. Recent Trends in Nucleotide Synthesis[J]. Chemical Reviews,2016, 116(14): 7854-7897.
8.Boscher C, Dennis J W, Nabi I R. Glycosylation, galectins and cellular signaling[J]. Curr. Opin. Cell Biol.,2011, 23(4): 383-392.
9.Gantt R W, Peltier-Pain P, Thorson J S. Enzymatic methods forglyco(diversification/randomization) of drugs and small molecules[J]. Nat. Prod. Rep.,2011, 28(11): 1811-1853.
10.DeAngelis P L, Liu J, Linhardt R J. Chemoenzymatic synthesis of glycosaminoglycans: Re-creating, re-modeling and re-designing nature's longest or most complex carbohydrate chains[J]. Glycobiology,2013, 23(7): 764-777.
11.DeAngelis P L. Microbial glycosaminoglycan glycosyltransferases[J]. Glycobiology,2002, 12(1): 9R-16R.
12.Barreteau H, Kovac A, Boniface A, et al. Cytoplasmic steps of peptidoglycan biosynthesis[J]. Fems Microbiol. Rev.,2008, 32(2): 168-207.
13.Moffatt J G, Khorana H G. Nucleoside Polyphosphates. X.1 The Synthesis and Some Reactions of Nucleoside-5' Phosphoromorpholidates and Related Compounds. Improved Methods for the Preparation of Nucleoside-5' Polyphosphates1[J]. J. Am. Chem. Soc.,1961, 83(3): 649-658.
14.Moffatt J G, Khorana H G. Nucleoside Polyphosphates. VIII.1 New and Improved Syntheses of Uridine Diphosphate Glucose and Flavin Adenine Dinucleotide UsingNucleoside-5' Phosphoramidates2[J]. J. Am. Chem. Soc.,1958, 80(14): 3756-3761.
15.MacDonald D L. Preparation of glycosyl phosphates. Betad-fructopyranose 2-phosphate[J]. The Journal of organic chemistry,1966, 31(2): 513-6.
16.Masuko S, Bera S, Green D E, et al. Chemoenzymatic Synthesis of Uridine Diphosphate-GlcNAc and Uridine Diphosphate-GalNAc Analogs for the Preparation of Unnatural Glycosaminoglycans[J]. J. Org. Chem.,2012, 77(3): 1449-1456.
17.Liu J, Linhardt R J. Chemoenzymatic synthesis of heparan sulfate and heparin[J]. Nat. Prod. Rep.,2014, 31(12): 1676-1685.
18.Konstantinova I D, Antonov K V, Fateev I V, et al. A Chemo-Enzymatic Synthesis of beta-D-Arabinofuranosyl Purine Nucleosides[J]. Synthesis,2011, (10): 1555-1560.
19.Watt G M, Flitsch S L, Fey S, et al. The preparation of deoxy derivatives of mannose-1-phosphate and their substrate specificity towards recombinant GDP-mannose pyrophosphorylase from Salmonella enterica, group B[J]. Tetrahedron: Asymmetry,2000, 11(2): 621-628.
20.Sabesan S, Neira S. SYNTHESIS OF GLYCOSYL PHOSPHATES AND AZIDES[J]. Carbohydr. Res.,1992, 223: 169-185.
21.Dinev Z, Wardak A Z, Brownlee R T C, et al. A convenient gram-scale synthesis of uridine diphospho(C-13(6))glucose[J]. Carbohydr. Res.,2006, 341(10): 1743-1747.
22.Zhang X, Green D E, Schultz V L, et al. Synthesis of 4-Azido-N-acetylhexosamine Uridine Diphosphate Donors: Clickable Glycosaminoglycans[J]. J. Org. Chem.,2017, 82(18): 9910-9915.
23.Schultz V L, Zhang X, Linkens K, et al. Chemoenzymatic Synthesis of 4-Fluoro-N-Acetylhexosamine Uridine Diphosphate Donors: Chain Terminators in Glycosaminoglycan Synthesis[J]. J. Org. Chem.,2017, 82(4): 2243-2248.
24.Feng F, Okuyama K, Niikura K, et al. Chemo-enzymatic synthesis of fluorinated 2-N-acetamidosugar nucleotides using UDP-GlcNAc pyrophosphorylase[J]. Org. Biomol. Chem.,2004, 2(11): 1617-1623.
25.Graziani A, Zamyatina A, Kosma P. A convenient synthesis of GDP D-glycero-alpha-D-manno-heptopyranose[J]. Carbohydr. Res.,2004, 339(1): 147-+.
26.Beswick L, Ahmadipour S, Dolan J P, et al. Chemical and enzymatic synthesis of the alginate sugar nucleotide building block: GDP-D-mannuronic acid[J]. Carbohydr. Res.,2019, 485: 7.
27.Blanot D, Auger G, Liger D, et al. SYNTHESIS OF ALPHA-ANOMER AND BETA-ANOMER OF UDP-N-ACETYLMURAMIC ACID[J]. Carbohydr. Res.,1994, 252: 107-115.
28.Nishimoto M, Kitaoka M. Identification of N-acetylhexosamine 1-kinase in the complete lacto-N-biose I/Galacto-N-Biose metabolic pathway in Bifidobactetium longum[J]. Appl. Environ. Microbiol.,2007, 73(20): 6444-6449.
29.Zhao G H, Guan W Y, Cai L, et al. Enzymatic route to preparative-scale synthesis of UDP-GlcNAc/GalNAc, their analogues and GDP-fucose[J]. Nat. Protoc.,2010, 5(4): 636-646.
30.Cai L, Guan W Y, Kitaoka M, et al. A chemoenzymatic route to N-acetylglucosamine-1-phosphate analogues: substrate specificity investigations of N-acetylhexosamine 1-kinase[J]. Chemical Communications,2009, (20): 2944-2946.
31.Chen Y, Li Y H, Yu H, et al. Tailored Design and Synthesis of Heparan Sulfate Oligosaccharide Analogues Using Sequential One-Pot Multienzyme Systems[J]. Angew. Chem.-Int. Edit.,2013, 52(45): 11852-11856.
32.Oberthur M, Leimkuhler C, Kahne D. A practical method for the stereoselective generation of beta-2-deoxy glycosyl phosphates[J]. Org. Lett.,2004, 6(17): 2873-2876.
33.Timmons S C, Jakeman D L. Stereospecific synthesis of sugar-1-phosphates and their conversion to sugar nucleotides[J]. Carbohydr. Res.,2008, 343(5): 865-874.
34.Prihar H S, Behrman E J. Phosphorylation of the hemiacetal hydroxyl group: Synthesis of β-D-mannopyranosyl phosphate[J]. Carbohydr. Res.,1972, 23(3): 456-459.
35.Prihar H S, Ji-Hsiung T, Wanamaker S R, et al. Synthesis of β-l-fucopyranosyl phosphate and l-fucofuranosyl phosphates by the MacDonald procedure[J]. Carbohydr. Res.,1977, 56(2): 315-324.
36.Stiller R, Thiem J. Enzymatic Synthesis of ß-L-Fucose-1-phosphate and GDP-fucose[J]. Liebigs Annalen der Chemie,1992, 1992(5): 467-471.
37.Gold H, van Delft P, Meeuwenoord N, et al. Synthesis of Sugar Nucleotides by Application of Phosphoramidites[J]. J. Org. Chem.,2008, 73(23): 9458-9460.
38.Berliner L J, Robinson R D. Structure-function relationships in lactose synthase. Structural requirements of the UDP-galactose binding site[J]. Biochemistry,1982, 21(25): 6340-6343.
39.Nordin J H, Salo W L, Bevill R D, et al. A vacuum system for the synthesis of nucleotide sugars on a micro scale[J]. Analytical Biochemistry,1965, 13(3): 405-411.
40.Mengin-Lecreulx D, van Heijenoort J. Copurification of glucosamine-1-phosphate acetyltransferase and N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase activities of Escherichia coli: characterization of the glmU gene product as a bifunctional enzyme catalyzing two subsequent steps in the pathway for UDP-N-acetylglucosamine synthesis[J]. Journal of bacteriology,1994, 176(18): 5788-95.
41.Guan W Y, Cai L, Fang J Q, et al. Enzymatic synthesis of UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc analogs using N-acetylglucosamine 1-phosphate uridyltransferase (GlmU)[J]. Chemical Communications,2009, (45): 6976-6978.
42.Weerapana E, Glover K J, Chen M M, et al. Investigating bacterial N-linked glycosylation: Synthesis and glycosyl acceptor activity of the undecaprenyl pyrophosphate-linked bacillosamine[J]. J. Am. Chem. Soc.,2005, 127(40): 13766-13767.
43.Li S, Wang S S, Fu X, et al. Sequential one-pot multienzyme synthesis of hyaluronan and its derivative[J]. Carbohydrate Polymers,2017, 178: 221-227.
44.Huang G L, Liu X, Zhang H C, et al. A facile two-step chemo-enzymatic synthesis of GDP-mannose[J]. Lett. Org. Chem.,2006, 3(9): 668-669.
45.Yu H, Yu H, Karpel R, et al. Chemoenzymatic synthesis of CMP-sialic acid derivatives by a one-pot two-enzyme system: Comparison of substrate flexibility of three microbial CMP-sialic acid synthetases[J]. Bioorganic & medicinal chemistry,2005, 12: 6427-35.
46.Brown C D, Rusek M S, Kiessling L L. Fluorosugar Chain Termination Agents as Probes of the Sequence Specificity of a Carbohydrate Polymerase[J]. J. Am. Chem. Soc.,2012, 134(15): 6552-6555.
47.Kiessling L L, Splain R A, Chemical Approaches to Glycobiology. In Annual Review of Biochemistry, Vol 79, Kornberg, R. D.; Raetz, C. R. H.; Rothman, J. E.; Thorner, J. W., Eds. Annual Reviews: Palo Alto,2010; Vol. 79, pp 619-653.
48.Zhang X, Pagadala V, Jester H M, et al. Chemoenzymatic synthesis of heparan sulfate and heparin oligosaccharides and NMR analysis: paving the way to a diverse library for glycobiologists[J]. Chem. Sci.,2017, 8(12): 7932-7940.
49.Zhang X, Dickinson D M, Lin L, et al. Chemoenzymatic synthesis of heparan sulfate tetrasaccharide from a N-acetyl-alpha-D-glucosamine-O-methylglycoside acceptor[J]. Tetrahedron Lett.,2019, 60(13): 911-915.
50.Zhang X, Xu Y M, Hsieh P H, et al. Chemoenzymatic synthesis of unmodified heparin oligosaccharides: cleavage of p-nitrophenyl glucuronide by alkaline and Smith degradation[J]. Org. Biomol. Chem.,2017, 15(5): 1222-1227.
51.Xu Y M, Chandarajoti K, Zhang X, et al. Synthetic oligosaccharides can replace animal-sourced low-molecular weight heparins[J]. Sci. Transl. Med.,2017, 9(406): 10.
52.Fuster M M, Esko J D. The sweet and sour of cancer: Glycans as novel therapeutic targets[J]. Nat. Rev. Cancer,2005, 5(7): 526-542.
53.Schachter H. Biosynthetic controls that determine the branching and microheterogeneity of protein-bound oligosaccharides[J]. Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire,1986, 64(3): 163-81.
54.Dennis J W, Nabi I R, Demetriou M. Metabolism, Cell Surface Organization, and Disease[J]. Cell,2009, 139(7): 1229-1241.
55.Brewer C F, Miceli M C, Baum L G. Clusters, bundles, arrays and lattices: novel mechanisms for lectin-saccharide-mediated cellular interactions[J]. Curr. Opin. Struct. Biol.,2002, 12(5): 616-623.
56.Nishimura S I, Hato M, Hyugaji S, et al. Glycomics for Drug Discovery: Metabolic Perturbation in Androgen-Independent Prostate Cancer Cells Induced by Unnatural Hexosamine Mimics[J]. Angew. Chem.-Int. Edit.,2012, 51(14): 3386-3390.
57.Johnson C H, Ivanisevic J, Siuzdak G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms[J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.,2016, 17(7): 451-459.
58.Zhang X, Han X R, Xia K, et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,2019, 116(19): 9208-9213.
59.Hippensteel J A, Anderson B J, Orfila J E, et al. Circulating heparan sulfate fragments mediate septic cognitive dysfunction[J]. J. Clin. Invest.,2019, 129(4): 1779-1784.
60.Best M D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules[J]. Biochemistry,2009, 48(28): 6571-6584.
61.Prescher J A, Bertozzi C R. Chemistry in living systems[J]. Nat. Chem. Biol.,2005, 1(1): 13-21.
62.Sletten E M, Bertozzi C R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality[J]. Angew. Chem.-Int. Edit.,2009, 48(38): 6974-6998.
63.He Y, Hinklin R J, Chang J Y, et al. Stereoselective N-glycosylation by Staudinger ligation[J]. Org. Lett.,2004, 6(24): 4479-4482.
64.Zhu S Y, Guo Z W. Chemical Synthesis of GPI Glycan Peptide Conjugates by Traceless Staudinger Ligation[J]. Org. Lett.,2017, 19(12): 3063-3066.
65.Huisgen R. 1.3‐Dipolare Cycloadditionen Rückschau und Ausblick[J]. Angew. Chem.-Int. Edit.,1963, 75(13): 604-637.
66.Sletten E M, Bertozzi C R. A hydrophilic azacyclooctyne for Cu-free click chemistry[J]. Org. Lett.,2008, 10(14): 3097-3099.
67.Wen L Q, Gadi M R, Zheng Y, et al. Chemoenzymatic Synthesis of Unnatural Nucleotide Sugars for Enzymatic Bioorthogonal Labeling[J]. ACS Catal.,2018, 8(8): 7659-7666.
68.Saxon E, Bertozzi C R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction[J]. Science,2000, 287(5460): 2007-2010.
69.Niederwieser A, Spate A K, Nguyen L D, et al. Two-Color Glycan Labeling of Live Cells by a Combination of DielsAlder and Click Chemistry[J]. Angew. Chem.-Int. Edit.,2013, 52(15): 4265-4268.
70.Sun T T, Yu S H, Zhao P, et al. One-Step Selective Exoenzymatic Labeling (SEEL) Strategy for the Biotinylation and Identification of Glycoproteins of LivingCells[J]. J. Am. Chem. Soc.,2016, 138(36): 11575-11582.
71.Lin L, Tian X D, Hong S L, et al. A Bioorthogonal Raman Reporter Strategy for SERS Detection of Glycans on Live Cells[J]. Angew. Chem.-Int. Edit.,2013, 52(28): 7266-7271.
72.Pham N D, Parker R B, Kohler J J. Photocrosslinking approaches to interactome mapping[J]. Curr. Opin. Chem. Biol.,2013, 17(1): 90-101.
73.Laughlin S T, Bertozzi C R. Imaging the glycome[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,2009, 106(1): 12-17.
74.Laughlin S T, Baskin J M, Amacher S L, et al. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish[J]. Science,2008, 320(5876): 664-667.
75.Bird-Lieberman E L, Neves A A, Lao-Sirieix P, et al. Molecular imaging using fluorescent lectins permits rapid endoscopic identification of dysplasia in Barrett's esophagus[J]. Nat. Med.,2012, 18(2): 315-321.
76.Zhu Y T, Wu J, Chen X. Metabolic Labeling and Imaging of N-Linked Glycans in Arabidopsis Thaliana[J]. Angew. Chem.-Int. Edit.,2016, 55(32): 9301-9305.
77.Batt A R, Zaro B W, Navarro M X, et al. Metabolic Chemical Reporters of Glycans Exhibit Cell-Type-Selective Metabolism and Glycoprotein Labeling[J]. ChemBioChem,2017, 18(13): 1177-1182.
78.He X M M, Liu H W. Formation of unusual sugars: Mechanistic studies and biosynthetic applications[J]. Annu. Rev. Biochem.,2002, 71: 701-754.
79.Xiao J B, Muzashvili T S, Georgiev M I. Advances in the biotechnological glycosylation of valuable flavonoids[J]. Biotechnol. Adv.,2014, 32(6): 1145-1156.
80.Chen D W, Fan S, Chen R D, et al. Probing and Engineering Key Residues for Bis-C-glycosylation and Promiscuity of a C-Glycosyltransferase[J]. ACS Catal.,2018, 8(6): 4917-4927.
来源：枫林糖话（ID：gh_87f7deafbe3b）
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