黑木耳母种分离所使用的培养基为完全培养基。其配方是：蛋白胨2.0g，磷酸氢钾1g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.46g，葡萄糖20g琼脂20g，蒸馏水1000毫升。

配置好的培养基装入三角瓶或分装在试管中，然后进行高压蒸汽灭菌，一般蒸汽压力为1.5千克/平方厘米下，灭菌20分钟即可。

种木的组织分离，运用种木分离比较容易获得原种，特别是黑木耳含胶质多，吸附作用强，采用子实体分离比较困难，因此分离母种常用种木组织分离。

供分离用的耳木必须选用表面看不到杂菌，子实体生长健壮的耳木，树皮脱落，木质腐朽的耳木不宜采用，在选好的耳木上再挑选黑木耳朵子生长健壮，附近又有耳芽的地方，锯下3-6厘米的小段，去掉树皮，从段面上分辨出有菌丝的部位，取下一小块作为分离的材料。分离材料经过表面消毒后，在无菌的条件下，用火焰灭菌过的解剖刀将它切成绿豆大小一样的颗粒，再用消毒过的镊子把它转放在盛有培养基的培养器皿内，每个培养器皿内放五粒，呈梅花形摆放，然后放在20-28摄氏度的恒温箱中培养，待其长出菌丝后，再移植纯化2-3次，即可得到原种。

分离材料表面消毒的方法是：用0.1%的生汞水消毒，步骤是取一只小酒杯，将种木放在杯内，倒进0.1%的生汞，然后用小棒连续搅动。浸3分钟后，用小棒拦住杯口将生汞水倒回原瓶，再用无菌水侵洗3次，第1次5分钟，第2次10分钟，第3次5分钟，然后用消毒过的镊子移入盛有培养基的培养器皿内。