撰文 | 小飞飞
责编 | 兮
嵌合抗原受体T（Chimeric antigen receptor，CAR-T）细胞免疫疗法对部分类型的造血系统肿瘤有不错的疗效。但对大多数实体肿瘤CAR-T细胞疗法的作用仍有限，其中的原因包括，肿瘤微环境中回输的CAR-T细胞扩增受限以及持续时间有限，这也促使人们去研究提高CAR-T细胞本身的内在功能的策略【1】。但同时，即使当CAR-T细胞成功的进入肿瘤，由于不表达CAR 抗原的肿瘤细胞大量增殖而会对CAR-T疗法产生抗性【2】。和CAR-T等适应性细胞疗法不同，免疫检查点阻断疗法（immune checkpoint blockade, ICB）通常通过提高内源性的T细胞的功能从而能对肿瘤细胞产生多种特异性的多克隆抗肿瘤效应【3】。对CAR-T细胞和ICB疗法，肿瘤微环境中免疫抑制蛋白比如PD-L1和抑制性细胞因子如TGFB都会阻碍免疫治疗的效果【4】。因此，发展能同时利用CAR-T细胞效应，提高内源性T细胞功能以及克服免疫抑制的微环境的联合治疗策略或可提高实体瘤对免疫治疗的响应。
模式识别受体(patter recognition receptors, PRRs)能识别组织损伤或者病原分子入侵产生的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）。PRRS激活引起的固有免疫反应是后续机体产生有效适应性免疫的先决条件。RIG-I和MDA5是胞质中识别病毒编码的具有5‘-三磷酸结构的双链RNA的PRRs，激活后能引起MAVS的寡聚从而启动下游干扰素的产生以及一系列干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs的表达【5】。这种天然免疫信号的激活对髓系细胞和树突状细胞(dendric cells, DCs)有效激活T细胞相当重要。最近研究表明，内源性的核酸也可以作为DAMPs激活PRRs。
RN7SL1（7SL）是细胞内具有一定结构的非编码RNA，正常情况下它和一些蛋白结合参与到蛋白质翻译过程中，同时这也保护它不被胞质内的RNAPRRs受体识别。但是在一些病理情况下，RN7SL1和蛋白结合减少，使得RN7SL1失去保护并通过细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）如外泌体分泌出去，随后类似病毒的RNA，RN7SL1在肿瘤细胞和髓系细胞中激活RIG-I依赖的炎症反应【6】。然而，不同细胞中诱导产生I型干扰素的结果也不同甚至是相反的。PRRs和IFN信号在DCs等免疫细胞中是免疫刺激作用的，而在肿瘤细胞这些信号通路的激活能促进肿瘤进展和免疫治疗抗性【6】。同时肿瘤细胞中，新抗原的缺失也使得内源性T细胞不能很好的清除肿瘤细胞。因此，在免疫细胞中而不是肿瘤细胞中靶向激活PRRs信号以及将新抗原传送至肿瘤细胞的策略将会极大提高肿瘤免疫治疗的效率。
2021年8月30日，来自美国宾夕法尼亚大学Perelman School of Medicine的Andy J. Minn团队和其合作者Carl H. June在Cell 上发表题为The immunostimulatory RNA RN7SL1 enables CAR-T cells to enhance autonomous and endogenous immune function的文章，通过在CAR-T细胞中引入RN7SL1，提高了CAR-T细胞功能，同时可选择性的激活免疫细胞中IFN/PRR通路，提高了内源性免疫系统对肿瘤的杀伤能力，极大提高了CAR-T细胞疗效。同时也可进一步在CAR-T细胞中装载抗原肽，更好克服CAR-T细胞治疗实体瘤时CAR抗原的缺失。
研究团队首先在体外检测RN7SL1（7SL）和对照RNA（scrambled RNA, Scr RNA）对PRRs通路激活情况。在B16-F10黑色素瘤细胞和人树突状细胞中转染RN7SL1能诱导MHC-1，PDL1和CD86等ISGs基因的表达。同时，RN7SL1诱导ISGs表达依赖于RIG-1和MDA5的同时存在而Scr RNA以及Poly I:C阳性对照都只依赖其中的一个蛋白，这表明RN7SL1在细胞内有其独特的信号通路。
随后研究者在T细胞缺失小鼠中构建B16肿瘤模型，瘤内注射脂质体包裹的RNA，和Scr对照相比，发现瘤内注射RN7SL1提高肿瘤生长降低了小鼠存活，这和之前研究也相一致在免疫缺陷环境下，肿瘤细胞中RN7SL1激活RIG-I促进肿瘤的生长和转移【6】。
在进一步免疫激活的条件下，研究团队瘤内注射RN7SL1的同时联合抗PD1和抗CTLA4免疫检查点阻断疗法，发现瘤内注射RN7SL1提高ICB治疗的响应和效果，RN7SL1增强了T细胞的浸润激活和增殖，提高了肿瘤中DCs的比例。这表明尽管激活肿瘤细胞内的RIG-I通路会促进肿瘤生长，但这种有害效应会被RN7SL1对免疫系统的激活所抵消（图1）。因此，特异性的将RN7SL1递送到免疫细胞而不是肿瘤细胞将会改善免疫治疗的效果。
图1 PRRs信号对肿瘤微环境中不同细胞的作用
研究团队猜想利用CAR-T细胞表达RN7SL1或可使得其能够选择性激活免疫细胞。研究团队首先利用人的CAR-T细胞模型，选择了两种在临床试验的CARs：抗人MSLN M5BBz-CAR和抗人CD19 19BBz CAR。在原代T细胞中表达这些CARs，同时在CAR 下游接连U6启动子表达的RN7SL1或对照RNA。研究团队研究RN7SL1是否对CAR-T细胞本身有影响。在人T细胞中表达这些CAR，在CAR-T细胞扩增后发现RN7SL1提高了CAR-T细胞中效应和记忆细胞的比例。同时在NSG小鼠中构建人异体移植肿瘤模型，发现RN7SL1可以显著提高CAR-T细胞的抗肿瘤效应，且也没有明显毒性。和对照CAR-T细胞以及肿瘤细胞相比，RN7SL1 CAR-T细胞表达更多的ISGs，且具有更强的效应功能和更久的持续时间。
研究团队之前的工作已经证明在肿瘤微环境中RN7SL1能通过外泌体在不同细胞中传递，因此作者假设在CAR-T细胞中表达RN7SL1除了对CAR-T细胞自身的作用之外，或许可通过细胞外囊泡激活其他细胞尤其是内源性的免疫细胞中的IFN信号。的确，不管是在人还是鼠的RN7SL1 CAR-T细胞分泌的外泌体中都能检测到RN7SL1。
为研究EVs中RN7SL1的作用，研究团队在免疫健全小鼠中构建鼠19BBz CAR-T细胞系统，首先利用特异性的RNA荧光染料（SytoRNA）标记CD45.1+小鼠CAR-T细胞，然后将其回输至CD45.2+的B16-F10(肿瘤细胞中表达了人CD19，B16-h19)荷瘤小鼠中。发现相当大一部分内源性CD45.2+免疫细胞都能被SytoRNA标记，包括髓系细胞，DCs以及T细胞，表明CAR-T细胞中RNA转移至这些细胞中。同时，抑制EV分泌也抑制了这种转移。qRT-PCR检测验证了RN7SL1从CAR-T细胞转移至内源性免疫细胞。同时流式分析发现CAR-T细胞来源EV RNA转移至免疫细胞的程度要明显多于肿瘤细胞。
小鼠模型中，19BBz-7SL CAR-T细胞和ICB疗法联用，明显提高了肿瘤治疗的效果，且肿瘤微环境中CAR-T细胞和内源性免疫细胞的浸润度增多，表明当内源性免疫系统被ICB招募激活之后, RN7SL1能进一步提高CAR-T细胞疗效。随后研究团队在肿瘤模型中仅利用RN7SL1 CAR-T细胞疗法而没有联合ICB，通过单细胞测序以及系列实验发现，CAR-T细胞中表达RN7SL1能限制肿瘤微环境中的髓系细胞的免疫抑制特征并促进树突状细胞的共刺激特征，也促进了内源性CD8 T细胞向效应记忆方向分化而不是趋向耗竭。而在CAR-T细胞中进一步装载抗原肽，也可减弱CAR 抗原丢失引起的CAR-T细胞疗法抵抗。
总之，本研究通过在CAR-T细胞中引入一个免疫刺激的RNA RN7SL1，不仅提高了CAR-T细胞本身的活力和功能，同时通过细胞外囊泡的递送，RN7SL1可选择性靶向内源性的免疫细胞，抑制髓系抑制性细胞的功能，激活树突状细胞，从而促进内源性T细胞的效应功能和扩增，也提高免疫系统对即使是没有CAR抗原的肿瘤的杀伤能力。为解决实体肿瘤对免疫治疗的抵抗，提供了新的破解之道。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.08.004
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