导语：光谱流式细胞仪作为流式细胞仪下的一个分支技术，但常规的流式细胞术使用二向色镜和带通滤光片来选择光谱的特定波段，以使用点检测器进行检测，其低分辨率限制了其在更复杂的光学分析中的实用性。而光谱流式细胞仪的光学和检测器的最新进展使得在亚毫秒级的时间范围内进行全光谱测量，弥补了传统流式细胞的检测缺陷。
01
光谱流式细胞仪与常规流式细胞仪的区别
1、色散区别
从收集的光子的角度来看，常规流式细胞仪和光谱流式细胞仪之间的第一个重要区别是色散。传统的流式细胞仪光学器件会根据其波长阻止、反射或透射光子，而光谱流式细胞仪则会根据波长分散光子。色散光学的两种最常见类型是棱镜和光栅。棱镜是经典的色散光学器件，它以波长相关的方式折射光。棱镜的通量通常非常高（>90％），并且色散在很宽的波长范围内都很有效，但是色散是非线性的，光谱分辨率随波长变化，通常在可见光中只有几纳米光谱。
2、检测器区别
常规流式细胞仪和光谱流式细胞仪之间的第二个主要区别是检测器。由棱镜或光栅产生的连续光谱的测量需要检测器的线性阵列。阵列中检测器的密度和间距以及色散光学器件的性能将决定分辨率。检测器技术近年来发展迅速，目前用于光谱流式细胞术的检测器是电荷耦合器和多阳极光电倍增管。
02
光谱流式细胞仪的发展及应用
1、当前发展情况
光谱流式细胞仪生物学应用的发展仍处于早期阶段，迄今为止，大多数已发表的研究都以论证或验证研究的形式进行。因此，对于仪器而言，重要的第一测试是对参考或校准的分析。例如，用不同荧光染料浸渍的聚合物微球用于在高分辨率光谱流式细胞仪的早期应用中证明荧光检测。后面的研究使用校准的多强度微球对仪器性能和灵敏度进行定量分析，表明它可与常规流式细胞仪媲美。抗体捕获珠在常规流式细胞仪中也广泛用于校准和补偿参考标准品，并且已以类似的方式用于光谱流式细胞仪。研究用对照粒子还已经用作校准和参考颗粒，用于使用基于纳米颗粒SERS标签的试剂进行测量。
2、免疫荧光检测
免疫荧光检测是流式细胞仪应用中最大的一类，而基于高速、低分辨率的光谱流式细胞仪已经证明了使用光谱流式细胞仪对外周血单核细胞进行免疫荧光检测及速度较慢的高分辨率系统的检测。在第一种情况下，研究人员使用主成分分析来识别淋巴细胞亚群，而后者的研究使用最小二乘光谱来确定与每个细胞结合的每种荧光抗体的量，并使用常规的基于参数的门控来识别亚群。使用纳米颗粒SERS标记抗体的免疫检测也已在培养的细胞上进行了证明，其研究使用了基于最小二乘的线性解混法来确定与细胞结合的标记抗体量。
3、细胞内在荧光检测
一种潜在的应用是细胞内在荧光的分析。自体荧光通常是流式细胞仪测量中背景的主要来源，并且已经描述了几种基于补偿或减法的方法来解释或校正其对总细胞信号的占比。细胞之间的自发荧光强度会有所不同，尤其是在异质原代细胞样品中，但其光谱通常与常用的荧光染料不同，这提供了使用光谱方法解释从内在细胞自发荧光与外在荧光探针分离信号的可能性。光谱流式细胞仪已被用来表征各种培养细胞系的自发荧光光谱，并且已经有报道描述了从荧光标记的信号中分离自发荧光的过程。
4、基于细胞的多重测定
光谱流式细胞术的另一个潜在的应用是在基于细胞的多重测定研究中。有多种分析方法对粒子、细胞或配体进行光学编码已被广泛应用，特别是在大规模系统生物学或高通量筛选研究中。对于荧光标记，例如具有更窄发射光谱的量子点或具有非常窄光谱特征的拉曼散射标记，光谱流式细胞术结合光谱分类方法有可能实现更高水平的使用光谱区域。
03
光谱流式细胞仪的选择
现代光谱流式细胞术在仪器设计和数据分析中提供了多种选择，最终的选择取决于生物学应用的需求。分析速度、灵敏度和光谱分辨率通常作为考虑因素，必须与生物学应用的需求相平衡。对于传统的流式细胞仪，高速测量意味着更短的测量时间和更少的光收集。在光谱流式细胞仪中，较高的分辨率导致相同数量的光分布在更多的检测器元件上，从而导致每次测量的光子更少。所使用的光谱数据分析方法将取决于被测组分的光谱是否已知且恒定，或者对被测光谱的占有是否有变化，这些因素还由实验设计和生物学应用的目的所限定。最后，需要根据细胞的光谱特征对细胞进行物理分类，这对数据采集和分析都产生了额外的要求，这将影响仪器参数的设定。
结语：多年来，人们进行了许多努力来开发流式细胞仪，光谱流式细胞仪的性能与荧光计相似，可以从单个颗粒中收集连续的高分辨率光谱。光谱流式细胞仪生物学应用的发展仍处于早期阶段，迄今为止，大多数已发表的研究都以论证或验证研究的形式进行。使用流式细胞仪作为光谱仪对单细胞进行全光谱分析，自该领域最早以来一直是仪器开发人员的目标。近年来，光学，检测器和电子设备的发展已使单细胞流动光谱学成为现实。随着一些研究实验室开始进行此类测量，以及功能强大的商业软件和关于即将发布商业仪器的发展，这种能力很可能推动新应用程序的开发以及光谱流式细胞术方法的进一步采用。
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