不加因子促分化？丝素蛋白水凝胶促心肌细胞分化机制解析

窦房结(SAN)功能障碍等心脏传导性疾病会引起心率减慢等症状，严重时甚至会引发心脏骤停。虽然现已使用电子起搏器等设备作为治疗的标准方法，然而，它们存在着器械毒性、发电机易故障、磁场对人体作用等固有缺陷。由细胞或基因操纵制造的生物起搏器已被发展成为一种无硬件的替代方法，但也仍然面临着载体免疫原性或体内传递效率低等方面的挑战。来自周围微环境的外部刺激，包括生物材料软硬度、各种小分子相互作用等是克服这些限制的潜在替代品，可独立于转录因子诱导重编程和心脏细胞的分化，但尚未在实验模型中成功测试。

为了探究生物材料对诱导静止心肌细胞转化为起搏细胞的影响与机制，台湾阳明交通大学Tze-Wen Chung团队联合台北荣民总医院Yu-Feng Hu团队分析了在不同的生物材料上培养的新生大鼠心室心肌细胞(VMs)，发现了丝素蛋白(SF)能将VMs转化为起搏心肌细胞。丝素诱导的起搏心肌细胞(SFSANs)在体外表现出真正的SAN心肌细胞的关键功能和形态学特征。全转录组分析发现在VMs上异位表达的Cdh5(血管内皮细胞粘附糖蛋白，VE-钙粘蛋白)是关键的表面分子。在SAN胚胎发生过程中，Cdh5的表达激活了β-catenin信号转导，并驱动转录因子的同时表达，从而激活了静态VMs向丝素蛋白诱导SAN的转化。在成年大鼠心室中注射丝素蛋白可原位产生一种替代性丝素SAN，具有体内生物起搏器活性和足够的自主神经反应。该工作以“Biomaterial-induced conversion of quiescent cardiomyocytes into pacemaker cells in rats”发表在《Nature Biomedical Engineering》。

作者首先将新鲜分离的新生大鼠VMs培养在不同生物材料的表面，包括纤连蛋白、丝素蛋白凝胶、Matrigel等11种凝胶上，在接种后5-7天分析了VM的博动率。与所有其他实验组相比，丝素蛋白VM在自发搏动的单层细胞中显示出最高的搏动率。HCN4离子通道传导超极化激活电流I f有助于SAN的自发搏动，实验发现丝素蛋白VM中HCN4的转录水平始终高于其他实验组。因此作者专注于把丝素蛋白作为将VM转化为起搏细胞的候选者，并探索了它们的详细电生理学、结构特征和潜在机制。

【SF处理的心肌细胞再现了SAN膜钟、钙钟特征】

通过膜片钳记录，丝素蛋白VM显示出自发动作电位、第4期舒张去极化和介于-50和-60 mV之间的微弱的负最大舒张电位。且在丝素蛋白VM中观察到不同程度的自发局部Ca2+释放事件(LCRs)，即驱动节律性细胞内Ca 2+循环，这是SAN心肌细胞自发搏动的标志，在对照组中没有观察到。

图1：SF处理的心肌细胞再现了真正SAN的钙钟特征

【SF处理的心肌细胞的结构特征】

SAN心肌细胞具有独特而复杂的结构来适应起搏进程。将大鼠SAN组织中的结构蛋白和离子通道与作为实验对照的心室的结构蛋白和离子通道进行了比较，发现这些特定基因在SAN组织和丝素蛋白VM之间表达水平相似。成熟的VM可以重新进入细胞周期，通过去分化增殖和形成新的心肌细胞，而去分化的调控基因（MYL2、ACTA1、ANP和Nkx2.5）保持不变或者被下调。且去分化的过程伴随着广泛的染色质重塑和干细胞增殖基因的激活，通过全转录组分析，发现丝素蛋白VM中染色质重塑因子和干细胞标志物的转录组变化很小。这些结果表明丝素蛋白诱导了谱系特异性基因而不是去分化。

图2：SF处理的心肌细胞的结构特征

【粘附分子Cdh5是起搏细胞转化机制的基础】

进行全转录组分析以鉴定差异表达的基因和关键机制。全面考察了与自发搏动速率相关的整合素、钙粘蛋白和连接蛋白家族的差异表达。Cdh5表达量增加最大，而其他分子要么下调，要么增加很小。Cdh5在心肌细胞中不表达而在丝素蛋白VM中再表达，并增加了激活形式、转录形式和β-catenin的核易位。通过中和抗体或siRNA抑制Cdh5，能阻止VM向起搏细胞的转化。

图3：粘附分子Cdh5是起搏细胞转化机制的基础

【SF诱导原位SAN替代物】

在房室传导阻滞的大鼠模型中，注射SF的大鼠心脏表现出源自注射部位的异位节律，发生率明显高于对照动物。在注射SF的心脏中，异位节律起源的传导速度低于远端区域，这与在SAN组织中观察到的细胞-细胞耦合减少相一致。且注射部位的原位起搏心肌细胞只能在注射SF的心脏中检测到，而不能在对照中检测到。这些发现表明丝素蛋白注射诱导了具有生物起搏活性的原位起搏细胞。

在丝素蛋白注射后6-8周从大鼠心脏中分离丝素蛋白VM，8周内细胞长宽比>12的起搏细胞百分比明显高于对照心脏。全细胞膜片钳对动作电位的记录显示出明显的自律性和舒张期去极化。使用房室传导阻滞大鼠模型，观察到注射SF的大鼠心脏表现出源自注射部位的异位节律。这都说明了起搏细胞表型的持久性。

图4：在大鼠心室中具有生物起搏活性的原位SAN替代物

【小结】

研究者们发现丝素蛋白通过Cdh5的异位表达，在体内和体外有效地将静止的心室心肌细胞转化为起搏细胞。丝素蛋白产生的起搏细胞通过无基因或载体传递的策略进一步促进了起搏细胞的产生，从而避免了基因突变和免疫原性。因此，这种基于丝素蛋白的技术代表了一种有前景的策略，可以替代基于基因或干细胞的生物起搏器，以创建体外SAN疾病模型或体内生物起搏器。

来源：高分子科学前沿

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