撰文 | 木兰之枻

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哈佛大学David Liu实验室开发的新型基因编辑器——引导编辑（prime editing，PE），是将逆转录酶MMLV与nCas9融合而得，该工具利用改造后的PE向导RNA（pegRNAs）引导融合蛋白，可实现四种碱基之间的自由替换，以及目标位点碱基的精准插入与删除【1】（）。已知碱基点突变及插入缺失突变可涵盖绝大多数致病遗传变异【2】，引导编辑在临床基因治疗研究中潜力巨大。为提升PE的基因编辑效率，研究者对pegRNAs进行了系统性改造并取得良好效果【3，4】（ ；，）。研究者还发现，利用双pegRNAs策略，也能提升Prime editing的碱基编辑效率和精准度【5】（）。此外，研究研究者还对Prime editing系统进行改造，实现了基因组大片段DNA的删除和替换【6，7】（）。

2021年12月9日，美国哈佛大学David Liu实验室在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing的论文。文章对Prime editing的应用做了进一步的拓展：利用配对的pegRNAs，研究者设计出twinPE策略，可实现基因组DNA大片段的删除、替换整合以及倒置，这为众多染色体结构变异相关的疾病模型构建及治疗提供了新的工具。

研究者此处开发的twinPE策略是传统PE策略的延伸，其基本原理是：以prime editing的融合蛋白为基础，设计靶向双链DNA不同链的配对pegRNAs。配对pegRNAs的核心改造在于互补的3’flap序列（图1）。利用配对的pegRNAs和融合蛋白，twinPE策略可以更高效的实现目标DNA序列的删除、替换或新DNA序列的插入（图1）。

图1 twinPE策略基本原理，红色序列为互补的3’flap序列。

随后研究者利用twinPE策略在HEK293T细胞中尝试进行大片段DNA的替换和删除。利用新策略，研究者能将长度为38bp的attB和50bp的attP序列高效插入基因组的特定位点（效率分别>80%和>50%）。此外，研究者还指出，与传统的PE2/3策略相比，twinPE策略能更加高效的将长度>100bp的序列插入至目标位点。随后研究者利用twinPE策略实现了苯丙酮尿症（PKU）致病基因PAH特定外显子的高效替换，这对于多种遗传病的治疗都有重要意义。除了利用twinPE进行大片段DNA替换外，研究者还设计出三种策略用于大片段DNA的删除，并比较了不同策略的效果。结果显示三种策略在大片段DNA删除中均有独特的优势。研究者还将相关策略用于杜氏肌营养不良症致病基因DMD第51号外显子的删除研究。结果显示，传统的Cas9策略有更高的删除效率，但删除精准度偏低；而twinPE策略在删除的精准度方面具有明显优势。最后，研究者还指出，twinPE策略并无明显的脱靶风险，具有很好的安全性。

TwinPE策略在DNA大片段插入方面仍然有局限性，一般不超过100bp。已知哺乳动物细胞中，Bxb1整合酶能将更大片段DNA定点整合至预设的attB和attP位点。为实现更大片段DNA的定点整合，研究者将twinPE与Bxb1整合酶联用，并在HEK293T细胞中验证了超大片段DNA整合的效果。研究者通过筛选发现， twinPE策略能将attB和attP序列高效整合至AAVS1以及CCR5位点。其中在CCR5位点整合有attB序列的细胞系中，研究者可利用Bxb1整合酶将携带attP序列且长度达5.6kb的外源DNA片段高效整合至CCR5位点中（效率为12%~17%）。随后研究者还证实，将PE融合蛋白、配对pegRNAs、Bxb1整合酶和5.6kb外源DNA片段同时转染至HEK293T细胞中也可实现外源大片段DNA的定向整合（效率为1.4%~6.8%），并且整合效率可通过多种途径进行优化提升。研究者还将twinPE+Bxb1联合策略用于ALB位点的大片段DNA整合研究（肝脏细胞中，ALB位点常用于外源治疗性转基因的整合）并证实了策略的有效性。最后研究者对该联合策略的脱靶风险进行分析，证实了该策略的安全性。

除了用于大片段DNA的定向整合外，研究者还利用twinPE+Bxb1策略实现了基因组中大片段DNA的倒置。通过将attB和attP序列定向整合至基因组不同位点，研究者实现了IDS和IDS2基因位点长度为40kb的大片段DNA的倒置，这为染色体异常相关的人类遗传病研究提供了新的工具。

本研究通过改造prime editing技术，成功的拓展了其应用场景。新设计的twinPE策略在大片段DNA的替换和删除方面具有优势。将twinPE与位点特异性整合酶Bxb1联合，更可以实现外源大片段DNA（5.6kb）的定点整合和超大片段基因组DNA（40kb）的倒置。TwinPE策略的出现让人类遗传病的基因治疗有了更多选择，也为大片段DNA的功能研究以及染色体结构变异相关的疾病模型构建提供了新的工具。

参考文献

1. Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature576, 149–157 (2019)

2. Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.Nat Rev Genet(2018).

3. Nelson, J.W., Randolph, P.B., Shen, S.P., Everette, K.A., Chen, P.J., Anzalone, A.V., Newby, G.A., An, M., Chen, J.C., and Liu, D.R. Engineered pegRNAs that improve prime editing efficiency.Nat. Biotechnol.(2021).

4. Chen P.J., Hussmann J.A., Yan J., Knipping F., Ravisankar P., Chen P.-F.et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes.Cell.2021; : 184

5. Zhuang, Y., Liu, J., Wu, H. et al. Increasing the efficiency and precision of prime editing with guide RNA pairs.Nat Chem Biol(2021).

6. Choi, J. et al. Precise genomic deletions using paired prime editing.Nat. Biotechnol.https://doi.org/10.1038/s41587-020 (2021).

7. Jiang, T., Zhang, XO., Weng, Z. et al. Deletion and replacement of long genomic sequences using prime editing.Nat Biotechnol(2021).

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-021-01133-w