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导读

人参中含有多种黄酮醇苷，具有多种生物活性，但人参中黄酮糖基化的研究报道甚少。结果表明，随着栽培年限的延长，人参皂苷和山奈酚3-O-葡萄糖苷在叶片中普遍积累。为探讨人参黄酮醇糖基化过程，我们采用数据非依赖型扫描模式（DIA）的蛋白质组学和系统发育分析方法，筛选出50个UDP糖基转移酶（UGTs），其中发现UGT92A10和UGT94Q4有助于山奈酚3-O-葡萄糖苷的形成。UGT73A18、UGT74T4和UGT75W1可催化山奈酚3-O-葡萄糖苷的半乳糖基化。在UGT75W1中发现Ser278、Trp335、Gln338和Val339与UDP半乳糖基通过分子对接形成氢键。MeJA诱导UGT73A18和UGT74T4的转录增加了4倍以上，与山奈酚3-O-葡萄糖苷的减少相一致，表明这些基因可能与人参抗逆境胁迫有关。这些结果强调了综合代谢谱、蛋白质组学和系统发育分析对探索人参黄酮醇糖基化的意义。

论文ID

原名： Identification of Specific Glycosyltransferases Involved in Flavonol Glucoside Biosynthesis in Ginseng Using Integrative Metabolite Profiles, DIA Proteomics, and Phylogenetic Analysis

译名： 综合代谢谱、DIA蛋白质组学和系统发育分析鉴定人参中参与黄酮醇苷生物合成的特异性糖基转移酶

期刊： Journal of Agricultural Food Chemistry

IF： 4.192

发表时间： 2021.02

通讯作者： 孙伟& 陈士林

通讯作者单位： 中国中医科学院

实验设计

1. 采用UPLC-MS-QqQ分析了不同栽培年限（2年、3年和4年）人参的叶、茎和根中的黄酮类化合物；

2. 2年生人参植株中获得这些组织以进行定量DIA分析；

3. 利用原核系统鉴定了22个重组PgUGT蛋白的功能，并利用UPLC-MS-Q-TOF对酶产物进行分析；

4. 利用系统发育分析进一步筛选人参基因组中注释的225个PgUGTs；

5. 进行PgUGTs的分子建模与对接；

6. 使用UGT73A18、UGT74T4和UGT75W1的转录表达谱来探索它们在体内的功能。

实验结果

1. 人参黄酮醇苷的时空分布特征

采用UPLC-MS-QqQ分析了不同栽培年限（2年、3年和4年）人参的叶、茎和根中的黄酮类化合物（图1A）。鉴定出六种黄酮醇化合物：山奈酚（K）、山奈酚3-葡萄糖苷（K3Glc）、山奈酚3-O-葡萄糖基-（1-2）-半乳糖苷（K3GalGlc、人参皂苷）、槲皮素（Q）、槲皮素3-葡萄糖苷（Q3Glc、异槲皮素）和槲皮素3-O-葡萄糖基-（1-6）-鼠李糖苷（芦丁）（表S1）。黄酮类化合物主要积累在叶片（528.63-1740.17 μg/gDW）和茎（547.73-795.84 μg/gDW）中，其次是根（7.64-13.99 μg/g DW）（图1B，C）。

人参皂苷和山奈酚3-O-葡萄糖苷主要在叶和茎中积累，芦丁主要在茎中积累。山奈酚和槲皮素3-O-葡萄糖苷在叶、茎和根中积累量较低。不同栽培年限的组织中总黄酮含量不同，叶和根中总黄酮含量随栽培年限的增加而增加，茎中总黄酮含量则下降。人参皂甙在叶片中的积累（图1B）随着年份的增加更为显著，4年生叶片中人参皂苷含量高达1584 μg/g DW，分别是茎和根中人参皂苷含量的4倍和1500倍。茎中芦丁和山奈酚3-葡萄糖苷含量随栽培年限的增加而显著下降，分别由2年生的442.9和264.93 μg/g DW下降到4年生的47.47和77.09 μg/g DW。虽然芦丁在根和叶中的含量随栽培年限的增加而增加，但其绝对含量较低（低于6 μg/g DW）。山奈酚3-O-葡萄糖苷含量在根中的增加幅度较小，但在4年生叶片中的增加幅度较大；槲皮素在根和叶中的含量随栽培年限的增加而增加，而在茎中的含量变化较小；此外，我们还发现，2年生茎（264.93 μg/g DW）中的黄酮类单苷山奈酚3-O-葡萄糖苷比4年生叶（148 μg/g DW）中的含量更高。

值得注意的是，在茎中，芦丁含量随着栽培年限的增加而降低，而芦丁的前体槲皮素3-葡萄糖苷含量没有增加，这表明芦丁可能经历其他修饰，例如酰化，这类似于花青素修饰。山奈酚和槲皮素在人参叶中含量很低（<10μg/g DW），这与Chung等人的结果一致。与其他物种类似，包括日本粗叶木、豆类和黄芩，黄酮类化合物主要以糖苷形式存在于人参中。

4年生叶片中山奈酚3-O-葡萄糖苷含量为148 μg/g DW，山奈酚二苷（panasenoside）含量高达1584 μg/g DW。有趣的是，山奈酚和槲皮素葡萄糖苷在人参根和3、4年生茎中的含量都很低，但2年生茎中山奈酚3-O-葡萄糖苷（264.9 μg/g DW）和芦丁（442.9 μg/gDW）的含量较高，可能是因为幼嫩茎也能合成黄酮类化合物。各供试组织中山奈酚和槲皮素的含量均较低，但山奈酚和槲皮素的糖基化产物以积累为主，说明糖基化对人参黄酮类化合物的稳定性起着重要作用。

图1 人参中黄酮醇苷的时空分布

（A）不同栽培年限（2-Y:2年生；3-Y:3年生；4-Y:4年生）的人参性状。（B）人参皂苷（K3GalGlc）和山奈酚3-O-葡萄糖苷（K3Glc）的结构：Glc，葡萄糖；Gal，半乳糖。（C）不同栽培年限人参不同组织中黄酮含量（μg/g DW）：K，山奈酚；K3Glc，山奈酚3-O-葡萄糖苷；K3GalGlc，山奈酚3-O-葡萄糖苷-（1-2）-半乳糖苷，人参皂苷；Q，槲皮素；Q3Glc，槲皮素3-O-葡萄糖苷；芦丁，槲皮素3-O-葡萄糖苷-（1-6）-鼠李糖苷。

2. 山奈酚3-O-葡萄糖苷的差异蛋白质组学及PgUGTs鉴定

基于黄酮醇苷在叶和根中的差异积累模式，从2年生人参植株中获得这些组织以进行定量DIA分析，以了解在酶催化过程中代谢物的动态变化（图S1A）。根据Xu等人的基因注释，在3个生物重复中共鉴定了4535个蛋白质，其中749个蛋白质在叶中的表达量是在根中的4倍（表S2和图S1B）。结合225个注释的UGT蛋白，选择10个全长的UGT在叶片中高表达，以评价其在黄酮醇苷形成中的作用。为了全面寻找UGT候选基因，我们参考了Kim等人报道的另一个版本的人参基因组，又选择了9个候选PGUGT（表S3，蛋白质的不同强度如图2A和图S2所示，PG33368的序列与Pg_S6708.2的序列相同）。

筛选的19个PgUGTs中有10个成功克隆到表达载体中。以UDP-葡萄糖为糖供体，重组PgUGT7（PG17220）和PgUGT12（PG33368，或Pg_S6708.2）可向山奈酚的3-OH中添加葡萄糖。以山奈酚为底物的PgUGT7和PgUGT12酶解产物中检测到449.1 m/z（[m+H]+，山奈酚3-葡萄糖苷），其保留时间和MS光谱与标准山奈酚3-O-葡萄糖苷相同（图2B，C）。蛋白质组学数据显示，叶片中PgUGT7（PG17220）和PgUGT12（PG33368或Pg_S6708.2）的丰度分别是根的1.7倍和5.4倍（图2A），这与叶中山奈酚3-O-葡萄糖苷含量是根的5倍以上（图1C）的代谢数据一致。

山奈酚3-O-半乳糖基转移酶和山奈酚3-O-半乳糖基转移酶分别参与山奈酚3-O-半乳糖苷和山奈酚3-O-半乳糖苷的形成，可产生山奈酚二糖苷（山奈酚3-O-葡萄糖基-（1-2）半乳糖苷）。以UDP-半乳糖/葡萄糖作为糖供体，以山奈酚或山奈酚3-O-半乳糖苷作为底物，对所有候选PgUGTs进行了测试。只有PgUGT12能催化山奈酚半乳糖苷和山奈酚二葡萄糖苷的形成，但其HPLC保留时间与山奈酚3-O-半乳糖苷和人参皂苷不一致（图S3）。系统发育分析显示PgUGT7和PgUGT12在黄酮醇的多个位点与糖基化的进化群聚集在一起，例如UGT79家族（图2D）。在UGT命名法委员会的帮助下，PgUGT7和PgUGT12分别被命名为UGT92A10和UGT94Q4。PgUGT12对山奈酚和山奈酚3-O-半乳糖苷的酶促能力与其在进化树中的位置一致，接近UGT79家族。

图2 从差异蛋白质组学数据鉴定PgUGTs

（A）叶向根的19个PgUGTs蛋白表达水平的上调倍数；（B）从PgUGT7和PgUGT12酶产物的UPLC-MS中提取的离子；第一个面板是从空载体（CK）和山奈酚（K）的离子（m/z 287.1）中提取的光谱，以下两幅图是分别以山奈酚为底物测定重组PgUGT7和PgUGT12产生的光谱提取离子（m/z 287.1）。（C）上一个图为山奈酚的质谱图；下一个图为山奈酚3-O-葡萄糖苷（K3Glc）的质谱图。（D）PgUGT7（PG17220）、PgUGT12（PG33368）和AtUGTs的分子系统发育树。将多个序列用Clustal X2进行比对，并用MEGA7.0进行最大似然法构建树。

3. 系统发育分析筛选候选 PgUGTs

利用系统发育分析进一步筛选人参基因组中注释的225个PgUGTs。共从UGT71、UGT73、UGT74、UGT74、UGT75、UGT76、UGT79、UGT84、UGT85、UGT91和UGT94家族中选择了34个候选PgUGTs进行进一步分析，包括那些报道的与其他物种中类黄酮相关的UGTs（三个PgUGTs与蛋白质组学数据中的候选相同；图3A和表S4）。然而，最终只有22个候选PgUGTs被克隆（表S5）。它们都含有植物次级产物糖基转移酶（PSPG）盒，由44个氨基酸组成，其中谷氨酰胺（Q）是PSPG盒的最后一个氨基酸。众所周知，谷氨酰胺是决定UGTs是否使用UDP-glucose作为糖供体的关键因素。

对已报道的UGTs进行系统发育分析表明，49个UGTs聚集成5个主要分支，可能为候选UGTs的酶功能提供线索（图3B）。其中，以ZmF3GT为代表的第一簇由8个UGT组成，它们催化黄酮类化合物3-OH位点的糖基化，但不包括PgUGT；第二个簇包含5个糖基化类黄酮5-OH位点的UGTs，例如PfA5GT，包括来自PgUGT74、PgUGT75、PgUGT76、PgUGT84和PgUGT85家族的11个成员，这说明簇中的PgUGTs可能催化黄酮类化合物5-OH的糖基化。在第三个分支中，PgUGT73A18与8个UGTs聚集在一起，这些UGTs对黄酮类化合物的7-OH位点进行糖基化。PgUGT71A27、PgUGT71A40和PgUGT71A41形成一个新分支，其中命名为UGTPg101的PgUGT71A27可以催化PPT型人参皂苷的糖基化。因此，PgUGT71A40和PgUGT71A41被预测参与人参皂苷的糖基化。分支形成簇由13个UGTs组成，它们能催化多步糖基化合成黄酮类化合物，如GmUGT79A6和Ip3GGT。该集群包括来自UGT79、UGT91和UGT94家族的七个候选PGUGT，包括上述确定的候选UGT94Q4。因此，在下一步的酶实验中，选择来自分支形成簇的PgUGT91S2/V1、PgUGT79B38和PgUGT94X1/W1/Q2作为重点。

图3 基于氨基酸序列的黄酮类糖基化PgUGTs分子系统发育树

（A）有代表性的34个候选PgUGT，属于不同的UGT家族；（B）用Clustal x2对多个序列进行比对，并用MEGA7.0构建树。GenBank材料如下：Am7GT，BAG16513.1[金鱼草]；At3G7GT，NP_181217.1 [拟南芥]；At5GT，NP_193146.1 [拟南芥]；At7GT，NP_567955.1 [拟南芥]；At3RT，NP_564357.1 [拟南芥]；At7RT，NP_564357.1 [拟南芥]；Cm1,2RhaT，Q8GVE3.2[柚子]；Cm7G2 RT，ACX70154.1[柑橘]；Ct3GT，3WC4_A[蝶豆]；FtUGT73BE5，MH197414[苦荞麦]Fi3GT，AAD21086.1[金连翘]；GelF7GT，BAC78438.1[甘草]；Hv3GT，P14726.1[大麦]；Ih3GT，BAD83701.1[荷兰鸢尾]；Ip3GGT，Q53UH5.1[甘薯]；IpA3G2-GT，Q53UH5.1[甘薯]；Lb7GlcT，BAG80536.1[枸杞]；PfA5GT，Q9ZR27.1[紫苏]；PhA3G6 RT，CAA50376.1[矮牵牛]；PhA5GT，BAA89009.1[矮牵牛]；Sb7GT，BAA83484.1[黄芩]；ThA5GT，BAC54093.1[黄刺玫]；VhA5GT，Q9ZR25.1[美女樱]；VmF3GT，BAA36972.1[黑吉豆]；Vv3GT，P51094.2[葡萄]；Zm3GT，P16165.1[玉米]。

4. 候选PgUGTs的酶活性

为了研究黄酮类化合物的二次糖基化，特别是山奈酚和槲皮素的二次糖基化，我们利用原核系统鉴定了 22 个重组 PgUGT 蛋白的功能。以 UDP- 葡萄糖或 UDP- 半乳糖为糖基供体，以山奈酚、槲皮素、山奈酚 3-O- 葡萄糖苷和槲皮素 3-O- 葡萄糖苷为底物进行酶活性测定。 UGT75W1 、 UGT74T1 和 UGT73A18 可通过使用 UDP 葡萄糖作为糖基供体催化槲皮素的羟基葡萄糖基化（图 4A 和图 S3 ）， UGT75W1 和 UGT73A18 也可以催化山奈酚的葡萄糖基化（图 4B ）。此外，这些 PgUGTs 可以催化山奈酚 3- 葡萄糖的半乳糖基化，使用 UDP 半乳糖作为糖基供体（图 4C ）。只有 UGT75W1 能将山奈酚半乳糖基化得到山奈酚半乳糖苷，但不同于山奈酚 3-O- 半乳糖苷，并催化山奈酚 3-O- 半乳糖的葡萄糖基化形成不同于人参皂苷的山奈酚二糖苷（图 S3 和 S4C ），其他候选 UGTs 不能用 UDP- 葡萄糖或 UDP- 半乳糖糖基化底物。

通过 UPLC-MS-Q-TOF 对酶产物的分析表明，用重组 UGT75W1 、 UGT74T4 和 UGT73A18 进行的分析产生了含有山奈酚和槲皮素的新产物（图 4D 和图 S5 ）。糖基化产物的 m/z 值增加了 162 （山奈酚和槲皮素的 m/z 值分别为 447 和 463 ）。用 UGT75W1 、 UGT74T1 和 UGT73A18 对山奈酚 3-O- 葡萄糖苷进行分析得到的半乳糖基化产物的 m/z 值为 609 （ m/z 值为 [m H] ），增加了 162 。根据研究中黄酮苷的标准品和质谱信息，对于槲皮素， UGT75W1 和 UGT73A18 的唯一糖基化产物可能分别为 7-O- 葡萄糖苷和 3-O- 葡萄糖苷， UGT74T4 的产物包括 7-O- 葡萄糖苷和 5-O- 葡萄糖苷。对于山奈酚， UGT75W1 测定的唯一糖基化产物可能是 7-O- 葡萄糖苷，而 UGT73A18 的糖基化产物包括三个新产物： 7-O- 葡萄糖苷、 5-O- 葡萄糖苷和 3-O- 葡萄糖苷。 UGT75W1 、 UGT74T1 和 UGT73A18 可催化山奈酚 3-O- 葡萄糖苷的半乳糖基化（图 4C 、 D ）。

系统发育分析表明， UGT73A18 属于 5-O-GT 分支，但酶活性分析表明， UGT73A18 能产生多种黄酮苷，包括 5-O- 苷和 3-O- 苷。 UGT75W1 和 UGT74T4 都属于 7-O-GT 分支。在酶活性测定中，两者均能使 7-OH 位点糖基化，此外， UGT74T4 能催化生成微量 5-O- 糖苷。这些结果表明这三种糖基转移酶具有底物特异性和区域选择性。

虽然 UGT73A18 、 UGT74T4 和 UGT75W1 可以催化黄酮醇糖基化，但它们有自己独特的催化特性。 UGT73A18 和 UGT75W1 催化槲皮素和山奈酚转化为相应的 3-O- 葡萄糖苷衍生物，而 UGT74T4 催化黄酮醇形成相关的 7-O- 葡萄糖苷和 5- 葡萄糖苷。为了进一步分析它们的催化性能，我们以黄酮（芹菜素和木犀草素）、 PA 单体（原花青素、儿茶素和表儿茶素）和黄烷醇（柚皮素）为底物， UDP 葡萄糖为糖供体，但没有发现新的产物。这些结果表明， UGT75W1 、 UGT74T4 和 UGT73A18 更喜欢黄酮醇作为底物。酶动力学实验表明， UGT73A18 对槲皮素的亲和力最高（ Km 值为 729.67 μM ），但低于苦荞的 FtUGT73BE5 （ Km ， 690 μM ）和日本粗叶木的 LjUGT72Z2 （ Km ， 68 μM ）。对山奈酚的亲和力 UGT75W1 （ Km ， 28.56 μM ）高于 UGT73A18 （ Km ， 412.05 μM ）， FtUGT73BE5 （ Km ， 40.26 μM ）和 LjUGT72Z2 （ Km ， 40 μM ）。当使用 UDP 半乳糖作为糖供体时， UGT75W1 （ Km ， 123.85 μM ）、 UGT73A18 （ Km ， 136.75 μM ）和 UGT74T4 （ Km ， 627.3 μM ）对山奈酚 3-O- 葡萄糖的酶活性不同（图 5A ）。三种 PgUGTs 在底物特异性（对黄酮醇的偏好）和多样性（对不同黄酮醇的亲和力）方面的相似性可能主要是由于它们的结构差异。

图4 黄酮醇重组PgUGTs酶解产物的鉴定

（A）含有槲皮素（Q）和重组UGT75W1（第一组）、UGT74T4（第二组）以及UGT73A18（第三组）的酶制剂的代表性HPLC色谱图，以及（B）含有山奈酚（K）和重组UGT75W1（第一组）以及UGT73A18（第二组）的酶制剂的代表性HPLC色谱图；（C）重组UGT75W1（第一组）、UGT74T4（第二组）和UGT73A18（第三组）含有山奈酚3-O-葡萄糖苷（K3Glc）和UDP-半乳糖（UDP-Gal）的酶产物的代表性HPLC色谱图；（D）通过UPLC-MS-Q-TOF测定重组PgUGTs酶产物的质谱。

5. PgUGTs 的分子建模与对接

如图 6B ， C 所示，底物山奈酚（ K ）和糖基供体 UDP 葡萄糖（ UDP Glc ）都位于与 UGT73A18 模型中的底物结合的口袋中（表 S6 ）。该分析揭示了一些残基，包括 Gly15 、 Ser286 、 Trp344 、 Gln347 和 Ser367 ，可以与山奈酚形成氢键（表 S7 ）。与 UGT73A18 一致， UGT75W1 的关键残基也与山奈酚结合，包括靠近 C 末端的 PSPG 的氨基酸，形成 Ser-Gln-Ser 基序（ UGT73A18 的残基包含 Ser286 、 Gln347 和 Ser367 ，而 UGT75W1 包含 Ser278 、 Gln338 和 Ser358 ）。 UGT75W1 C 端的 Phe240 、 Arg345 和 Ile347 与 UDP 葡萄糖形成氢键，这与大多数 β 型糖基转移酶的键基序相同。相比之下，在 UGT73A18 N 端， His14 、 Thr80 、 Asp81 、 Gln82 、 Leu83 和 Thr84 形成氢键。因此， UGT75W1 与 UDP 葡萄糖和山奈酚的对接效果优于 UGT73A18 ，这与它们的酶活性结果一致（ UGT75W1 对山奈酚的 Km 值为 28.56 μM 、 UGT73A18 山奈酚的 Km 值为 412.06 μM ）。

在对接口袋中， UGT75W1 和山奈酚 3-O- 葡萄糖苷之间形成氢键的关键位点包括 Gln15 、 Thr254 和 Leu255 ，它们位于 N 端和环区，而 UGT75W1 和 UDP 半乳糖之间形成氢键的关键位点包括 Ser278 、 Trp335 、 Gln338 、 Val339 ，它们位于 C 末端和环区（图 5E ， F ）。然而， UGT73A18 和 UGT74T4 与 UDP 半乳糖和山奈酚 3-O- 葡萄糖苷的对接结果与 UGT75W1 不同。与 UDP 半乳糖形成氢键的残基主要位于 UGT73A18 和 UGT74T4 的 N- 末端和环中（图 S6 ），这可以解释为什么 UGT75W1 对 UDP 半乳糖和山奈酚 3-O- 葡萄糖苷的亲和力最高（ Km 值为 123.85μM ）。

根据 UGT73A18 和 UGT74T4 的对接结果，我们发现 UDP 葡萄糖主要与靠近 N 端的残基有关，这与 C 端 PSPG 盒与 UDP 葡萄糖结合的常识相冲突。 UGT73A18 和 UDP 葡萄糖的结合亲和力不如 UGT75W1 ，表明接近中性粒的残基可以与 UDP 葡萄糖结合，但效率不如 PSPG 盒中的残基。氨基酸位点 Ser278 、 Trp335 、 Gln338 和 Val339 可能是 UGT75W1 和山奈酚 3- 葡萄糖苷通过分子对接有效结合的关键位点；此外， Trp335 、 Gln338 和 Val339 位于 PSPG 基序中（图 S3A ），这可能为改进 UGTs 提供可选位点。

图5 PgUGTs的特性、同系物模型及与黄酮类化合物的对接

（A）重组PgUGTs的代表性动力学参数（Q，槲皮素；K，山奈酚；K3Glc，山奈酚3-O-葡萄糖苷；UDP-Glc，UDP-葡萄糖；UDP-Gal，UDP-半乳糖）。数值代表酶测定的平均值±标准差。（B，C）与UDP-葡萄糖（UDP-Glc）和山奈酚（K）对接的UGT73A18的代表性结合域（右图）和整体视图。（D，E）UGT75W1与UDP-半乳糖（UDP-Gal）和山奈酚3-O-葡萄糖（K3Glc）对接的代表性结合域（右图）和整体视图。配体形式的氨基酸与UDP葡萄糖供体和受体以黑色突出显示。糖供体UDP-葡萄糖（UDP-Glc）或UDP-半乳糖（UDP-Gal）呈黄色棒状；底物呈绿色，如山奈酚（K）和山奈酚3-O-葡萄糖苷（K3Glc）。

6. MeJA处理后植物中PgUGTs的表达谱

酶法分析表明， UGT73A18 、 UGT74T4 和 UGT75W1 对黄酮醇葡萄糖苷具有活性，但在先前的研究中未发现有关这些蛋白质的蛋白质组学数据。因此，我们使用 UGT73A18 、 UGT74T4 和 UGT75W1 的转录表达谱来探索它们在体内的功能（图 6A ）。 UGT73A18 和 UGT75W1 在叶片中均高表达，但表达趋势不同。 UGT73A18 主要在幼叶（ 2 年生和 3 年生）中表达，而 UGT75W1 主要在老叶（ 4 年生）中表达，相反， UGT74T4 在 4 年生根中高表达。根据酶活性和组织表达谱， UGT73A18 可能参与了叶和茎中黄酮醇苷的形成。 UGT73A18 、 UGT74T4 和 UGT75W1 可使 3-O- 葡萄糖苷半乳糖基化，因此根据 UGT74T4 和 UGT75W1 的表达模式，人参根或叶中可能存在至少两种山奈酚二糖苷。

MeJA 处理 24 小时后，叶片中人参皂苷的含量显著增加（高达 50% ），但山奈酚 3-O- 葡萄糖苷的含量降低（图 6B ）。此外， qRT PCR 数据显示， MeJA 处理叶片中 UGT73A18 、 UGT74T4 和 UGT75W1 的转录水平在 24 小时后显著上调，其中 UGT74T4 上调了 6 倍（图 6C ）。随着 3 个 PgUGTs 转录产物的上调， MeJA 处理后山奈酚 3-O- 葡萄糖苷的含量下降，暗示这些 PgUGTs 在体内可以催化山奈酚 3-O- 葡萄糖苷作为底物形成山奈酚二糖苷。 MeJA 处理诱导了 UGT73A18 、 UGT74T4 和 UGT75W1 的表达，表明其可能参与了不利条件下黄酮醇葡萄糖苷的产生，与苦荞另一种黄酮醇葡萄糖基转移酶 FtUGT73BE5 一样， MeJA 处理可诱导幼苗产生黄酮醇葡萄糖苷。

图6 PgUGTs的表达谱及其与MeJA的关系

（A）四种PgUGTs在人参不同栽培年限不同组织中的相对表达。（B）MeJA处理后叶片中人参皂苷（K3GalGlc）和山奈酚3-O-葡萄糖（K3Glc）的含量；（C）MeJA处理24h后4种PgUGTs在2年生叶片中的相对表达。

结论

综上所述，人参叶和根中黄酮醇苷和蛋白质在发育过程中发生动态变化。随着栽培年限的延长，人参叶片中人参皂苷和山奈酚 3-O- 葡萄糖苷的积累量分别达到 1584 和 148μg/g DW 。在 29 个候选品种中， UGT92A10 和 UGT94Q4 在叶片中被发现上调，并证实有助于山奈酚 3-O- 葡萄糖苷的糖基化。根据 225 个 PgUGTs 的系统发育分析，通过酶活性测试、转录谱和类黄酮代谢实验，发现 UGT73A18 、 UGT74T4 和 UGT75W1 参与了类黄酮苷的第二次半乳糖基化。这项工作提供了一个综合的方法，利用综合代谢概况，蛋白质组学数据和系统发育分析，以阐明黄酮醇糖基化的机制。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.0c06989

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