责编｜酶美

在组成人体的几十万亿细胞中，绝大多数细胞都共享着同样的基因组。然而，这些共享相同基因组的细胞却能分化出成千上万种功能迥异的细胞类型。这种神奇的现象是通过基因网络的多稳态 (Multistability) 性质实现的。搭建合成多稳态基因网络 (synthetic multistable circuits) 能帮我们更好地了解这类基因网络的设计原理， 同时也能为人工多细胞系统提供新的合成生物学工具。在哺乳动物细胞中，现有的合成多稳态基因网络能实现最简单的双稳态【1–3】，但人们尚不清楚如何设计可拓展的多稳态基因网络来建立和控制更多的细胞稳态 (cellular state)。

2022年1月20日，来自美国加州理工学院的Michael Elowitz研究组（第一作者为博士生朱镕徽）在Science上在线发表题为Synthetic multistability in mammalian cells的研究论文。在这篇研究论文中，作者们设计并搭建了一套名为MultiFate的多稳态基因网络， 并通过数学模型和实验结果展示了MultiFate的多稳态性，可控性和可拓展性。

为设计MultiFate寻找灵感，作者们首先观察了各种自然界中的多稳态系统，并发现了这些系统们两个常见的特点：1. 这些系统中的各种蛋白（常是转录因子）经常以许多不同的方式相互匹配，形成二聚体和多聚体；2. 不同带有转录因子二聚体 (dimer) 或多聚体 (multimer) 能识别并激活/抑制不同的基因程序，其中包括激活它们自己的基因表达，形成正反馈回路（图1）。

图1 具有代表性的自然多稳态系统（蓝色实线箭头代表二聚化过程，橙色虚线箭头代表正反馈回路）

基于这两个常见特点，作者们设计了MultiFate多稳态系统。在这个系统中，不同种的转录因子共有一个相同的二聚化功能域 (dimerization domain)。因此，每种转录因子既可以与同种的转录因子匹配，形成同源二聚体 (homodimer)；也可以与不同种的转录因子匹配，形成异源二聚体 (heterodimer)。只有同源二聚体能够结合相应转录因子基因的启动子，并激活基因表达，从而形成正反馈回路。异源二聚体不能结合任何启动子，因此异源二聚体化的过程会同时消耗两种转录因子。MultiFate从而通过异源二聚体化实现转录因子的互相抑制（图2）。

图2 包含两种转录因子的MultiFate-2系统

作者们首先通过数学模型验证这个设计的可行性。模型分析显示包含两种转录因子的MultiFate-2系统能实现多种多稳态形式，包括双稳态、三稳态和四稳态。通过异源二聚体化互相抑制的设计还让MultiFate系统具有可拓展性——加入新的转录因子能指数型地增加多稳态形式的数量。

理论验证了设计的可行性后，作者们着手开始在哺乳动物细胞内搭建MultiFate系统。作者们首先从合成锌指(zinc finger)功能域开始，设计并构建了一套拥有不同锌指功能域合成转录因子。这些转录因子能以同源二聚体的形式正反馈激活自己的表达，并通过形成异源二聚体相互抑制。作者们还使用了可控的二聚化功能域并加入了降解决定子(degron)来实现对二聚化和降解过程的药物控制。

作者们接着通过Piggybac转座子工具把两种合成转录因子（A和B）整合到哺乳动物基因组中。编码这两种转录因子的合成基因同时还表达两种不同的荧光蛋白，因此作者们可以通过这两种荧光蛋白的亮度测量两种转录因子的表达水平。在筛选出来的MultiFate-2单克隆细胞系中，作者们通过荧光流式细胞技术和荧光显微镜，观察到细胞能稳定存在三种不同的细胞稳态中——只表达A（Aonly，动图3红色细胞），只表达B（Bonly，动图3绿色细胞），同时表达A和B（A+B，动图3黄色细胞）。实验结果与理论分析相吻合，一起证明了MultiFate系统能够实现多稳态。

动图3 通过荧光显微镜拍摄的延时摄影直观展示了MultiFate-2细胞能在生长和分裂过程中稳定存在于三个不同的细胞稳态中

基于MultiFate-2细胞系，作者们继续整合进一种新的合成转录因子（C）并筛选出包含三种转录因子的MultiFate-3单克隆细胞系。运用相同的实验手段，作者们观察到这些细胞能稳定存在七种不同的细胞稳态中（动图4），同样与理论分析相吻合。以此展示了MultiFate系统的可拓展性。动图4 通过荧光显微镜拍摄的延时摄影直观展示了MultiFate-3细胞能在生长和分裂过程中稳定存在于七个不同的细胞稳态中。

图4

数学模型分析显示，MultiFate的稳态数量可以通过各种变量来调节。其中，在MultiFate-2的三稳态系统中，A+B稳态会随着转录因子蛋白稳定性的降低而消失。在已搭建好的MultiFate-2细胞系中，作者们可以通过转录因子上的可控降解决定子和相对应的药物，调节转录因子蛋白的稳定性。与模型预测相吻合，降低蛋白稳定性的操作使A+B稳态变得不稳定，原来在这个稳态的细胞自发地转移到Aonly或者Bonly稳态中。作者们进一步展示，这种转移是不可逆的——重新恢复蛋白稳定性并不能让细胞回到A+B稳态中（图5）。这一现象与干细胞不可逆的分化过程相类似【4–6】。作者们最后在MultiFate-3细胞系中也用调节蛋白稳定性的方式展示了MultiFate稳态数量的可控性。

图5 调节蛋白稳定性能控制MultiFate稳态数量，并制造与干细胞不可逆分化相类似的现象。

总的来说，作者们总结自然多稳态系统的共有特点，并应用这些特点设计并搭建了一个可控和可拓展的合成多稳态系统MultiFate。通过使用一套合成转录因子，MultiFate系统能建立多个至少长达数周的细胞稳态。可控性让合成生物学家能通过MultiFate重现自然细胞分化中出现的各种有趣现象。可拓展性让MultiFate能满足未来人工多细胞系统越来越多细胞类型的要求。MultiFate未来还可与其他合成生物学工具相结合，为新的多细胞合成生物应用提供架构基础。

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.abg9765

制版人：十一

参考文献

1. B. P. Kramer, A. U. Viretta, M. Daoud-El-Baba, D. Aubel, W. Weber, M. Fussenegger, An engineered epigenetic transgene switch in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 867–870 (2004).

2. T. Lebar, U. Bezeljak, A. Golob, M. Jerala, L. Kadunc, B. Pirš, M. Stražar, D. Vučko, U. Zupančič, M. Benčina, V. Forstnerič, R. Gaber, J. Lonzarić, A. Majerle, A. Oblak, A. Smole, R. Jerala, A bistable genetic switch based on designable DNA-binding domains. Nat. Commun. 5, 5007 (2014).

3. D. R. Burrill, M. C. Inniss, P. M. Boyle, P. A. Silver, Synthetic memory circuits for tracking human cell fate. Genes Dev. 26, 1486–1497 (2012).

4. S. Huang, Y.-P. Guo, G. May, T. Enver, Bifurcation dynamics in lineage-commitment in bipotent progenitor cells. Dev. Biol. 305, 695–713 (2007).

5. W. Xiong, J. E. Ferrell Jr, A positive-feedback-based bistable “memory module” that governs a cell fate decision. Nature. 426, 460–465 (2003).

6. A. Gunne-Braden, A. Sullivan, B. Gharibi, R. S. M. Sheriff, A. Maity, Y.-F. Wang, A. Edwards, M. Jiang, M. Howell, R. Goldstone, R. Wollman, P. East, S. D. M. Santos, GATA3 Mediates a Fast, Irreversible Commitment to BMP4-Driven Differentiation in Human Embryonic Stem Cells. Cell Stem Cell. 26, 693–706.e9 (2020).

转载须知

【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究