这期给大家分享本课题组近日在Chinese Medicine杂志发表的研究论文，题目是Exploring biological basis of Syndrome differentiation in coronary heart disease patients with two distinct Syndromes by integrated multi-omics and network pharmacology strategy.

摘要

背景：中医治病讲究辨证论治，针对同一疾病的不同证型使用不同的方剂。本研究旨在探讨其内在机制。

方法：采用临床样本蛋白质组学、代谢组学、与六种经典中药方剂的网络药理学相结合的策略，系统探讨冠心病（CHD）两个典型证候 - 寒凝气滞（CCQS）和气滞血瘀（QSBS）中医辨证的生物学基础。

结果：本研究表明，伴有CCQS的CHD患者的特征是泛酸和辅酶A生物合成发生改变，而QSBS的CHD患者在代谢方面的改变包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，以及乙醛酸和二羧酸代谢。而且，PON1和ADIPOQ的表达下调可能是CCQS证候的潜在生物标志物，而APOE和APOA1的表达下调可能是QSBS证候的潜在生物标志物。此外，网络药理学和多组学联合分析表明，两种证候之间可能存在既往病史或并发症方面的差异，寒凝气滞型患者以糖尿病为主，气滞血瘀患者以缺血性中风为主。这些结果证实了我们的假设，即由特定证候的复方所调节的分子和生物过程可能与该疾病证候引起的功能失调相关。

结论：本研究为探索中医辨证的生物学基础提供了循证策略，有助于中医理论在精准医学实践中的转化。

一、研究流程

研究流程见图1. 首先采用代谢组学和蛋白质组学对寒凝气滞型和气滞血瘀型冠心病患者血清进行分析，然后选择了6种治疗寒凝气滞型和气滞血瘀型冠心病的经典中药复方进行网络药理学分析，最后在网络药理学、代谢组学和蛋白质组学的结果之间进行交叉验证。

二、 临床样本的特征

本研究共纳入111名受试者，其中包括CCQS证候的CHD患者（n＝44）、QSBS证候的CHD患者（n＝37）和健康对照组（HC，n＝30），分别于2018年8月至2019年12月在北京中医药大学附属东直门医院心血管门诊或周边社区进行注册。临床样本的各项指标特征见表1.

表1显示，CCQS组和QSBS组在年龄、性别、BMI和实验室数据方面没有显著差异。然而，这两组患者的既往病史上存在一些差异。CCQS组糖尿病患者比例较高，而QSBS组高血压、高脂血症和脑血管病患者比例较高。这些差异在一定程度上反映了两种证型各自的特点。

三、CCQS和QSBS患者的蛋白质组学研究

临床样本的蛋白质组学分析结果见图2. 在CCQS、QSBS和HC组中分别鉴定出353、355和354种蛋白（图2A）。标准样品分析所得的95%以上的定量蛋白质的变异系数（CV）低于10%（图2B）。CCQS组和HC组之间有24种差异蛋白，其中5种上调，19种下调（图2C）。QSBS组和HC组之间共鉴定了23种差异蛋白，其中9种上调，14种下调（图2D）。通过交集分析，7种蛋白是两种证候共有的差异蛋白（DPs），而17和16种蛋白质分别是CCQS和QSBS的特异性DPs（图2E）。

将两种证候的DPs分别输入GeneMania平台，构建它们的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。该平台使用标签传播算法，根据输入列表中所有基因的连接，对整个人类基因组PPI网络中的每个基因进行评分。得分较高的基因与输入基因有更高的功能关联，它们更可能受到输入基因的影响。对于每个输入基因列表，我们添加了其他10个得分最高的基因来构建PPI网络（图2F，G）。然后，使用STRING平台分别对两个PPI网络中的DPs和基因进行KEGG通路富集分析。图3H显示，所有4组基因均在胆固醇代谢途径中富集，而3组基因也在PPAR信号途径、维生素消化和吸收、以及脂肪消化和吸收中富集。表明这4条通路都与CCQS和QSBS的发生和发展有关。另一方面，只有QSBS的两组基因在其他4条途径中富集，包括补体和凝血级联途径。

最后，应用DAVID的功能注释聚类工具，分别识别富集CCQS和QSBS的DPs（分类严格度设置为“高”）的疾病类。表2显示，两种证候的DPs均显著富集与冠心病直接相关的基因，包括炎症、心血管疾病、冠状动脉疾病和冠状动脉粥样硬化。除了这些共同点之外，CCQS的DPs还在包括胰岛素抵抗、代谢综合征和2型糖尿病的疾病基因富集，而QSBS的DPs富集与静脉血栓栓塞、脑缺血、中风和阿尔茨海默病相关的基因。两种证候的DPs所富集的疾病基因的区别与两种证候临床样本的共病性差异一致。

四、CCQS和QSBS患者的代谢组学研究

为了探讨CCQS和QSBS之间的代谢差异，我们构建了偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型。在非靶向（图3A）和靶向代谢组学（图3B）中，CCQS和QSBS患者的血清代谢组与PLS-DA评分图上的健康对照组明显分离。已鉴定的差异代谢物（DMs）分为10类，其中甘油磷脂（25.3%）、脂肪酰（23.3%）和氨基酸（14.4%）是三种最具影响力的代谢物（图3C）。CCQS患者血清中200种代谢物发生显著变化，QSBS患者血清中225种代谢物发生显著变化，包括两种证候中110种DMs的共同改变（图3D和补充文件1：表S1）。这些结果提示了冠心病患者特有的代谢特征，以及CCQS和QSBS之间的共同代谢特征。

我们使用MetaboAnalyst平台对DMs进行功能富集分析。与健康对照组相比，CCQS患者血清中的DMs富集在七种不同的代谢通路，包括脂质代谢（不饱和脂肪酸的生物合成、甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、鞘脂代谢）、氨基酸代谢（半胱氨酸和蛋氨酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢）、辅助因子和维生素代谢（泛酸和辅酶A生物合成）（图3E）。与健康对照组相比，QSBS患者血清的DMs富集在十种不同的代谢途径，包括脂代谢（亚油酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成）、氨基酸代谢（丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及精氨酸生物合成）、其他氨基酸代谢（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢）、翻译（氨酰-tRNA生物合成），碳水化合物代谢（乙醛酸和二羧酸代谢）（图3F）。图3G显示，2组差异代谢物均富集于2条脂质代谢通路（亚油酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成）和2条氨基酸代谢通路（甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢）。此外，CCQS的DMs在另外两条脂质代谢途径中富集，即甘油磷脂代谢和鞘脂代谢；QSB的DMs富集于4条氨基酸代谢途径，包括精氨酸代谢、酪氨酸代谢和两条谷氨酸代谢途径。

接下来，我们通过Cytoscape软件绘制了富集DMs的差异代谢通路网络（图4）。

五、代谢组-蛋白质组联合分析和ROC诊断

使用MetaboAnalyst平台研究与同一证候相关的差异代谢物和差异蛋白之间的相互作用。将同一证候的DMs和DPs输入MetaboAnalyst，构建了该证候的代谢物-蛋白质关联网络（图5A、B）。三种脂肪酸代谢物（花生四烯酸、亚油酸、二十碳五烯酸）和一种蛋白质（APOB）是两个网络中包含的相同代谢物和蛋白质。花生四烯酸、亚油酸、二十碳五烯酸是与炎症显著相关的脂肪酸代谢物，这表明炎症可能是这两种证候的共同特征。图5C显示了两种证候的DMs和DPs富集的通路（p<0.05）。所有5种共同的通路与仅用蛋白质组学分析（胆固醇代谢、维生素消化和吸收、脂肪消化和吸收）或代谢组学分析（亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成）识别到的通路一致。前面仅用代谢组学分析也识别到一种特异的CCQS相关通路（鞘脂代谢）和两条QSBS特异性通路（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢）。

接下来，用二元逻辑回归分析对这两种证候的特异的DPs和DMs进行ROC诊断分析。在蛋白质组学实验中，发现生物标记物组（ACTA2、FCGBP、LBP、IGHM）可以准确区分CCQ患者和健康对照组（图5D）。然而，我们发现，由于特异性和敏感性降低（AUC=0.607），当区分QSBS和健康对照组时，生物标记物组的表现较差（图5D）。类似地，生物标记物组（CFHR3、EFEMP1、UBA52、APOD、CAT）能够准确区分QSBS患者和健康对照组（AUC=0.86），并且由于特异性和敏感性降低（AUC=0.592），在区分CCQS和健康对照组时表现不佳（图5E）。在代谢组学实验中，我们还发现两个生物标记物组（l-缬氨酸、泛碱、lysoPC（20:2）、1-磷酸鞘氨醇）和（焦谷氨酸、乙酸、PC（20:1/14:1）、socitric acid）能够准确区分CCQS和QSBS患者与健康对照组（图5F、G）。

六、治疗冠心病CCQS或QSBS证候临床中药复方的网络药理学分析

为了通过中药方剂研究这两种不同证候的特征，我们选择了在临床上广泛用于治疗冠心病CCQS或QSBS证候、并在《中国药典》中记载的6种中药复方，每个证型对应选择了3个复方。CCQS的复方为麝香保心丸、冠心苏合丸、宽心气雾剂；QSBS的复方为速效救心丸、血府逐瘀丸和复方丹参滴丸（表3）。为简单起见，将对应于CCQS和QSBS的复方分别编码为F1和F2；F1型三个复方分别编码为F1-1、F1-2和F1-3；F2型复方编码为F2-1、F2-2和F2-3（表3；每个复方中的草药见补充文件1：表S2）。

对于中药配方中的每种草药，首先从ETCM和TCMSP数据库中收集其化学成分和相应的潜在靶标。用OB≥ 30%和DL≥ 018筛选来自TCMSP数据库的成分；对来自ETCM数据库的化合物，Druglikeness Gradings为好或中等的成分被视为活性化合物。然后，从中国药典中检索每种草药的质量标记（Q-maker），因为其药理作用已得到验证；从HERB数据库中搜索每个Q-maker的相应靶标。综合所有数据，最终获得了6个复方中26种不同草药的696种活性化合物（补充文件1：表S3），其中528种活性化合物具有1246个潜在靶标（表3和补充文件1：表S4）。

我们将CCQS和QSBS的3个复方的共同靶标分别视为相应复方类别的标签靶标。这两类复方分别有252个和218个标签靶标（图6A，B）。这两类复方有182个共同的标签靶标，我们将仅为F1或F2复方的标签靶标的70个和36个分别视为这两类复方的F1和F2特异标签靶标（图6C）。

为了了解这两类复方的功效，我们将签名靶标与FDA批准的冠心病相关药物靶点进行比较。首先用关键词“Coronary Heart Disease”搜索DisGenet数据库，查找冠心病相关疾病。将阈值设置为JIg>0.2和JIv>0.05，其中JIg和JIv分别表示基于共同基因和共同变异的Jaccard指数，我们确定了15种与CHD高度相关的疾病（补充文件1：表S5）。在DrugBank数据库中，治疗这些疾病的药物可根据其解剖治疗化学（ATC）代码分为4类，即心血管系统（ATC ID:C）、糖尿病（ATC ID:A10）、肥胖（ATC ID:A08）和缺血性中风（ATC ID:B01）。

然后，我们将两类复方的共同和特异性标签靶标映射到DrugBank数据库中4类药物的靶标。注意，这里我们只研究了DrugBank库中的药理学靶点，排除了药物的转运体、载体和代谢酶。如图6D和E所示，共同标签靶点与所有4类药物靶点都有重叠。F1和F2特异性靶标与心血管系统药物靶点重叠。然而，F1特异性靶标也与糖尿病的药物靶点重叠，而F2特异性靶标与缺血性中风和肥胖的药物靶点重合。提示除治疗冠心病外，F1方对冠心病的糖尿病并发症治疗更为重视，F2方对冠心病的缺血性脑卒中并发症治疗更为有效。特异标签指标的差异与临床样本中疾病共病性的差异一致，表明某一证候的特异复方调节的靶标和通路可能是特异于该证候的功能受损蛋白和通路。

七、网络药理学与多组学联合分析

我们使用MetaboAnalyst平台研究代谢产物与同一证候相关基因之间的相互作用。将DMs、DPs和CCQS的签名靶点输入MetaboAnalyst，并构建CCQS的整合代谢物-基因网络（图7A）。该网络包括35个DMs和102个与CCQS相关的基因之间的相互作用。除了对应于这两种证候的共同分子外，该网络还包含14个CCQS特异的DMs和2个DPs，以及17个F1特异的签名靶点。相同方法构建了QSBS的代谢物-基因网络，其中包含QSBS特异的14个DMs、4个DPs、以及10个F2特异性签名靶标（图7B）。

然后，我们应用MetaboAnalyst平台对两个代谢物-基因网络进行功能注释。我们重点分析了KEGG数据库的基本生物学途径，包含5个部分：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和组织系统。将CCQS代谢物-基因网络中的所有分子，包括DMs、DPs和签名靶点，输入MetaboAnalyst，鉴定出86条富集CCQS相关分子的通路（p<0.05）。同样，发现80条通路富集与QSBS相关的分子（p<0.05）。我们对两组通路进行交集分析，发现两种证候共有66条共同通路，其中前35条通路如图7C所示。CCQ和QSB分别有20和14条特异通路（图7D，E）。66条共同通路中有7条为代谢通路，其中3条也仅通过代谢组学结果确定，即甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；不饱和脂肪酸的生物合成；亚油酸代谢。蛋白质组学分析确定的两条共同通路（胆固醇代谢、PPAR信号途径）也通过联合分析所确定。在代谢组学和联合分析中都发现了CCQS的一条特异通路（泛酸和辅酶A生物合成）。通过代谢组学分析确定了QSBS的三条特异通路（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢）。

接下来，我们应用DAVID平台来识别整合网络中富集的证候特异性基因的疾病类。我们将CCQS的代谢物-基因网络中的2个DPs和17个特异性靶点输入DAVID，并进行分类严格度为“高”的功能注释聚类。QSBS的代谢物-基因网络中的特异基因也以同样的方式进行分析。表4显示，两种证候中超过20%的特异基因与冠状动脉粥样硬化和其他直接与冠心病相关的疾病显著相关。除了这些共同疾病外，CCQS特异性基因还富集代谢综合征的疾病基因，而QSBS特异性基因则富集与脑血管疾病、中风和高脂血症相关的基因。此外，参与这些疾病的CCQS特异性DPs为PON1和ADIPOQ，而参与这些疾病的QSBS特异性DPs为APOE和APOA1。

八、结论

综合临床样本、多组学和网络药理学分析，我们的研究表明，冠心病的CCQS和QSBS证候均与5条代谢通路的功能障碍有关：甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；不饱和脂肪酸生物合成；亚油酸代谢；胆固醇代谢；PPAR信号通路。此外，冠心病CCQS证候的特征是泛酸和辅酶A生物合成改变，而QSBS证候则与D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，以及乙醛酸和二羧酸代谢的失调相关。我们的结果还表明，PON1和ADIPOQ的表达下调可能与CCQS的病理学有关，而APOE和APOA1的表达下调可能与QSBS的病理学有关。此外，临床样本和网络药理学结果表明，CCQS或QSBS分别与糖尿病或缺血性中风的病理高度相关。这种共病现象是否与两种证候的内在差异有关，尚需进一步研究。本研究有助于我们从现代生物医学的角度理解中医证候，促进中医理论在精准医学实践中的应用。

参考文献：

Wu G, Zhao J, Zhao J, Song N, Zheng N, Zeng Y, Yao T, Zhang J, Weng J, Yuan M, Zhou H, Shen X, Li H, Zhang W. Exploring biological basis of Syndrome differentiation in coronary heart disease patients with two distinct Syndromes by integrated multi-omics and network pharmacology strategy. Chin Med. 2021 Oct 26;16(1):109. doi: 10.1186/s13020-021-00521-3. PMID: 34702323; PMCID: PMC8549214.

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