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肺作为进行气体交换的器官，其对于生物个体存活的重要性不言而喻。近年来随着各种技术手段，尤其是单细胞测序技术的突飞猛进，我们对于肺发育、肺功能和各种肺相关疾病（显然，这其中包括COVID19）有了进一步的认知。通过大规模数据整合与跨机构合作，小鼠以及人类肺细胞的系统分类和功能描述得以初步实现【1-4】。然而与其他肺部细胞相比，我们对于一种罕见且形态特殊的肺上皮细胞——肺神经内分泌细胞（Pulmonary Neuroendocrine Cell，PNEC）的认知尚处于起步阶段。

2018年，UCSD孙欣实验室通过在发育早期的内皮层细胞中敲除决定PNEC分化的转录因子Ascl1，构建了PNEC缺失的突变体小鼠，并首次揭示了PNEC在放大哮喘引起的免疫反应中的作用【5】（第一作者为隋鹏飞博士，现任中科院分子细胞科学卓创中心研究员）。值得注意的是，PNEC的数量增长及其分泌的神经肽（如降钙素基因相关肽，Calcitonin Gene-Related Peptide，CGRP）水平的异常增加也曾在其他肺部疾病（如慢性阻塞性肺病chronic obstructive pulmonary disease，肺囊性纤维化cystic fibrosis等）中被报道【6,7】，但这些变化与上述疾病间的关系尚不明了。

在与PNEC相关的肺部疾病中，婴儿神经内分泌细胞增生症（Neuroendocrine Hyperplasia of Infancy，NEHI）是一种特殊的罕见病。顾名思义，此疾病的病理特征是患者肺部活体组织检查（biopsy）较正常个体肺部活检能发现更多的PNEC。NEHI患者在出生后6月到2年间会表现出一系列包括发育迟滞、低血氧、呼吸时伴有异响等症状【8】。令人困惑的是，除了有更多的PNEC外，NEHI病人的肺部结构无论在大尺度（如CT造影）还是微观尺度上（如活检）都与常人无异。自从2005年被正式报道以来，关于NEHI成病机制的研究并无重大进展。这一情况一方面由于NEHI作为一种罕见病，获取病人的生理病理数据殊为不易；另一方面，传统基于一手病人样本的病理学分析所得有限，并不能系统、高效地推进机理研究。因此，NEHI至今仍缺乏有效的治疗手段，患者只能依赖长时间给氧缓解病情。

暂抛上述种种现实困境，NEHI的核心问题在于1）PNEC的异常增加是否导致了其他症状，抑或仅仅是NEHI的一种附带表型；2）如果PNEC的异常增加确为致病缘由，其后的分子机理为何。从更纯粹的科学角度上看，NEHI模型亦可被视为一种PNEC的功能获得性（gain of function，g-o-f）模型，若与孙欣实验室在2018年报道过的PNEC功能缺失性（loss of function，l-o-f）模型相互鉴证，能更近一步加深我们对于这种独特上皮细胞的认知。

上述一切设想的突破口仰赖于找到一种能精准还原关键NEHI病理特征的动物模型。在这一点上，NEHI是罕见病这一事实也非全然不利。大量的实例（比如人尽皆知的红绿色盲）告诉我们：强表型的罕见病往往与单基因（或少数几个基因）的突变或调控失常有关。幸运的是，一个家族性的NEHI病例在2013年见诸报道【9】。在此家族中，所有NEHI患者在基因NKX2-1上均带有一个点突变，这最终导致了NKX2-1蛋白的191（在小鼠中为161）位氨基酸由精氨酸（Arg）变为亮氨酸（Leu）。

2022年3月17日，孙欣团队（第一作者为徐晋皞博士）在Developmental Cell上发表了文章Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange，揭示了婴儿神经内分泌细胞增生症的成病机制。

NKX2-1是肺发育的决定性转录因子，在小鼠和人中高度保守。研究人员利用CRISPR/Cas9技术对同一位点进行点突变，从而得到了携带Nkx2-1R161L（简写为Nkx2-1L）等位基因的突变体小鼠。进一步的表型分析显示，当小鼠携带两个Nkx2-1L基因拷贝时，虽然其肺发育和肺上皮细胞分化不受影响，但会表现出1）PNEC异常增加；2）出生后早期发育迟滞；3）低血氧。此三者正是NEHI的关键病征。与此同时，还发现NEHI突变体的肺相较于对照组含有更多非炎症导致的组织液。这一发现使研究人员得到了除生长曲线和血氧水平以外又一可以准确量化的生理参数（通过测量肺的干湿比）。综上所述，研究人员认为Nkx2-1L/L突变体是一种理想的NEHI小鼠模型。

有了这一模型，系统性地研究上文所述关于NEHI成因的病理学问题和关于PNEC功能的生物学问题不再是镜花水月。首先，通过在NEHI突变体中敲除Ascl1（前文提到过，Ascl1是决定PNEC分化的重要转录因子），发现PNEC的增长仍收束在Ascl1通路上。换言之，尽管在NEHI突变体中PNEC增多，但导致这一变化的基因调控网络的最下游仍由Ascl1控制，并不涉及其他新的转录因子。据此，研究人员利用2018年报道过的遗传学方法构建了PNEC缺失的NEHI突变体（Nkx2-1L/L; Ascl1cKO），发现与NEHI突变体相比，PNEC缺失的NEHI突变体不再表现出明显的NEHI表型（包括生长滞缓，低血氧和肺部组织液增加）。这一发现揭示了PNEC的异常增加的确对其他的NEHI表型有所贡献，而并非是一种附带表型。

为了进一步理解PNEC异常增加引起NEHI表型的机制，研究人员收集了小鼠的支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）液，试图从其中找到与PNEC相关的细胞或分子信号。在NEHI突变体的肺灌洗液中，神经肽CGRP的水平大幅上升。由于这一分子在肺中主要由PNEC合成并分泌，故而PNEC缺失的NEHI突变体不再有高于正常水平的CGRP。研究人员还发现，如若让野生型小鼠出生后多次吸入高于正常生理水平的CGRP，其肺部组织液会显著增加。反之，若在NEHI突变体中敲除CGRP的编码基因Calca，NEHI表型将不再显著。这说明PNEC异常增加使得CGRP高于正常生理水平，此变化是NEHI表型产生的重要因素。

既然CGRP在介导NEHI表型中起到了关键性的作用，那么它的靶细胞是什么？具体分子机制又为何？已发表的单细胞测序结果显示【10】，肺内皮细胞（endothelial cells）高度特异性地表达CGRP的G蛋白偶联受体Calcrl。于是，研究人员分别从刚断奶的野生型或NEHI突变体小鼠肺中用流式细胞仪分选出上皮细胞和内皮细胞并进行了单细胞测序分析。发现PNEC与内皮细胞间有极高的信号交流强度，这其中大半又由CGRP介导。更精细的数据分析显示：NEHI突变体中内皮细胞的cAMP-CREB信号通路强度显著增加，研究人员认为这恰是高浓度CGRP长期作用于内皮细胞所致。类似的长时程cAMP-CREB信号激活在体外系统中已有研究，在此情境下内皮细胞间的紧密连接会受到损伤，从而导致血管通透性增加、组织液外渗【11】。在单细胞基因表达数据中，内皮细胞特异的紧密连接蛋白Cldn5的表达量在NEHI突变体中确有下降。研究人员利用包括定量PCR、Western Blot和免疫荧光染色在内的实验手段进一步验证了这一发现。另外，研究人员也用染料标记的方法证实了NEHI突变体的组织液渗漏来自于内皮细胞。最后，无论是用遗传学方法在肺内皮细胞中敲除CGRP受体基因Calcrl，还是通过药理学手段阻断CGRP介导的信号通路，NEHI突变体都不再表现出NEHI相关表型。这些结果很好地说明了长时程、高浓度的CGRP环境会损伤内皮细胞，因此而过量外渗的组织液最终导致气体交换效率下降、血氧浓度降低。

鉴于上述机制也可能适用于其他有肺水肿（edema）病征的疾病（如急性呼吸窘迫综合征Acute respiratory distress syndrome, ARDS和新冠COVID19），研究人员与多家医院合作取得了ARDS和COVID19病人的肺组织样本，并进行了基于免疫荧光染色的组织学分析。与对照组相比，ARDS和COVID19样本中的PNEC大量表达CGRP，同时伴有内皮细胞CLDN5蛋白水平的大幅度下降【12】。虽然肺水肿的病理复杂，绝不能简单归因于PNEC过量表达CGRP损伤上皮细胞，但两者间很可能存在尚未被完全理解的紧密联系。更重要的是，由于市场上已有三种治疗偏头痛的CGRP信号阻断剂，再利用这些药物提供了一种缓解乃至治疗包括NEHI、ARDS、COVID19在内的肺部疾病的可能。

另：孙欣教授实验室（Sunlab in UCSD）使用包括大规模数据分析、小鼠模型构建、发育/神经/免疫领域的主流技术在内的多种手段研究肺的发育和再生、肺相关疾病机制以及肺与其他器官的互相作用。孙欣教授在肺相关领域拥有极佳的声誉和学术水平。实验室拥有充足的经费、丰富的资源以及广泛的合作。Sunlab长期接受博士后申请。如有意者欢迎访问实验室网站（http://xinsunlab.org/）或直接扫码投递简历。

简历投递（有意者请将个人简历等材料发至）：

https://jinshuju.net/f/ZqXwZt

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2022.02.023

制版人：十一

参考文献

1 Sun, X. et al. A census of the lung: CellCards from LungMAP.Dev Cell57, 112-145 e112, doi:10.1016/j.devcel.2021.11.007 (2022).

2 Zepp, J. A. et al. Genomic, epigenomic, and biophysical cues controlling the emergence of the lung alveolus.Science371, doi:10.1126/science.abc3172 (2021).

3 Montoro, D. T. et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.Nature560, 319-324, doi:10.1038/s41586-018-0393-7 (2018).

4 Travaglini, K. J. et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing.Nature587, 619-625, doi:10.1038/s41586-020-2922-4 (2020).

5 Sui, P. et al. Pulmonary neuroendocrine cells amplify allergic asthma responses.Science360, doi:10.1126/science.aan8546 (2018).

6 Garg, A., Sui, P., Verheyden, J. M., Young, L. R. & Sun, X. Consider the lung as a sensory organ: A tip from pulmonary neuroendocrine cells.Curr Top Dev Biol132, 67-89, doi:10.1016/bs.ctdb.2018.12.002 (2019).

7 Xu, J., Yu, H. & Sun, X. Less Is More: Rare Pulmonary Neuroendocrine Cells Function as Critical Sensors in Lung.Dev Cell55, 123-132, doi:10.1016/j.devcel.2020.09.024 (2020).

8 Deterding, R. R., Pye, C., Fan, L. L. & Langston, C. Persistent tachypnea of infancy is associated with neuroendocrine cell hyperplasia.Pediatr Pulmonol40, 157-165, doi:10.1002/ppul.20243 (2005).

9 Young, L. R., Deutsch, G. H., Bokulic, R. E., Brody, A. S. & Nogee, L. M. A mutation in TTF1/NKX2.1 is associated with familial neuroendocrine cell hyperplasia of infancy.Chest144, 1199-1206, doi:10.1378/chest.13-0811 (2013).

10 Du, Y. et al. Lung Gene Expression Analysis (LGEA): an integrative web portal for comprehensive gene expression data analysis in lung development.Thorax72, 481-484, doi:10.1136/thoraxjnl-2016-209598 (2017).

11 Perrot, C. Y., Sawada, J. & Komatsu, M. Prolonged activation of cAMP signaling leads to endothelial barrier disruption via transcriptional repression of RRAS.FASEB J, fj201700818RRR, doi:10.1096/fj.201700818RRR (2018).

12 D'Agnillo, F. et al. Lung epithelial and endothelial damage, loss of tissue repair, inhibition of fibrinolysis, and cellular senescence in fatal COVID-19.Sci Transl Med13, eabj7790, doi:10.1126/scitranslmed.abj7790 (2021).

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