南中医&浙大宁波研究院通过介导代谢及相关信号通路揭示桑叶活性成分组协同改善糖尿病肾病机制|介导|大鼠|活性|糖尿病|血清

编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

桑叶对糖尿病及其并发症的疗效优异，但其有效成分的组合是否对体内糖尿病肾病（DN）具有保护和协同作用仍然不清楚。本研究旨在探讨桑树生物碱（MA）和黄酮类药物提取物（MF）组合（MAF1：1和MAF1：5）的保护和协同作用。采用网络药理预测、动物体内验证和代谢机制研究的分步方法，本文构建了桑叶抗DN的多组分-靶点-通路网络。首先，本研究通过网络药理学分析探讨了桑树叶对DN的潜在成分和机制，其次，建立了DN动物模型以验证这些潜在化合物的抗DN活性。网络药理学的结果表明，在MA和MF中出现了7种化合物，表现出抗DN活性，它们的机制与代谢途径，花生素代谢，鞘脂信号通路等显著相关。动物实验的结果表明，MAF1：1和MAF1：5通过调节Wnt/β-catenin和TGF-β/Smads信号传导途径显著减轻代谢紊乱。代谢组学研究表明，它们能通过花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢和鞘脂代谢调节16种血清和7种尿内源性代谢物，从而减轻DN。考虑到其对DN大鼠的治疗效果优于单一使用MA或MF，MAF1：1和MAF1：5 可能具有协同效应。MAF1:1和MAF1:5对DN大鼠具有多靶点、多途径的协同保护作用。这些研究结果对揭示桑叶防治肾病的优势具有重要的科学意义和应用价值。

论文ID

原名：Combination of mulberry leaf active components possessed synergetic effect on SD rats with diabetic nephropathy by mediating metabolism, Wnt/β-catenin and TGF-β/Smads signaling pathway

译名：通过介导代谢，Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号通路，桑叶活性组分的组合对糖尿病肾病的SD大鼠具有协同作用

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：4.360

发表时间：2022.01

通讯作者：宿树兰&彭昕

通讯作者单位：南京中医药大学&浙江大学宁波研究院

实验设计

实验结果

1. 桑叶治疗DN潜在靶点的筛选

通过TCMSP、TCMID和文献检索，我们共获得桑叶中黄酮类、生物碱类、酚酸类、萜类、二苯乙烯类化合物等120种成分。同时，满足条件的靶点有179个，总频率为579，对应57个成分。高频的前10个靶点是O43570，P00918，P43166，Q16790，P00915，P22748，P15121，Q9ULX7，P22303，P23280。这些结果表明，桑叶对各种疾病的治疗作用取决于各种化合物及其靶点的协同作用。每个组分的靶点数是不同的。57个组分中不仅有特定靶点，还具有重叠的靶点，这为其多组分的协同效应提供了证据。

关于DN靶点的识别，我们从Gene Cards和DigSee数据库中检索到2781个与DN相关的靶点。维恩图得到106个桑叶-DN靶点(图1A)。最终，桑叶中共有55个成分与106个DN相关靶点存在强关联。随后，我们利用Cytoscape软件构建了疾病-成分-靶点网络，明确疾病、活性成分和潜在靶点之间的关系。该网络由160个节点和411条边组成，包括1个疾病、55个生物活性成分和106个靶点。绿色，红色和蓝色节点分别代表疾病，生物活性化合物和靶点。如图1B所示，同一个活性成分可以作用于多个不同的靶点，同一个靶点可以与多个活性成分交互。根据与靶点的相互作用数量，我们预测槲皮素、山奈酚和1-DNJ为桑叶治疗DN的关键活性成分。

图1 桑叶对DN治疗潜在靶点的网络分析

(A)桑叶靶点和DN靶点的维恩图；(B)疾病-化合物-靶点网络。蓝色节点代表桑叶-DN交叉蛋白，绿色节点代表DN，红色节点代表桑叶活性化合物。

2. PPI网络的构建与分析

PPI网络由STRING数据库制作，如图2A所示。网络中的节点和边缘分别表示靶蛋白和蛋白-蛋白关联。经网络分析仪工具分析，网络中共有86个节点，259条边(图2B)。平均节点度和聚类系数分别为6.143和0.495。我们通过交互数量来鉴别枢纽靶点（即评价整个网络本质的关键节点）。如图2B所示，PIK3CA是该网络中最关键的枢纽靶点，与系膜细胞扩张和肾小管损伤密切相关，其次是PIK3R1、SRC、EGFR、AKT1、EGFR、PIK3CB、ESR1。网络中这些具有高degree值的蛋白靶点可能是桑叶治疗DN的原因。

图2 PPI网络的建立和分析

(A) PPI网络是使用STRING数据库构建的。网络中的节点代表蛋白质。空节点表示未知的3D结构蛋白，实心节点表示已知或预测的3D结构蛋白。边缘表示蛋白-蛋白关联。不同颜色的边缘表示不同的相互作用。(B) Cytoscape软件模拟了PPI。节点的大小和颜色代表靶点度值，节点的大小越大，其度值越大。节点颜色由红变绿，度值变大。边缘的厚度代表综合得分。边缘越厚，分数越高。

3. 桑叶用于DN处理的GO和KEGG通路富集分析

为阐明桑叶防治DN的作用机制，我们将106个药物-疾病靶点录入DAVID数据库进行了GO和KEGG通路富集分析。GO分析共获得218份具有统计学意义的通路(P<0.01)，其中BP为141份，CC为24份，MF为53份。而且这些靶点主要富集于氧化-还原过程、碳水化合物代谢过程、炎症反应等(图3A)。KEGG富集分析显示，共74条通路具有统计学意义(P<0.01)，其中大部分靶点与代谢通路、胰岛素抵抗、鞘脂信号通路等密切相关。我们利用Cytoscape软件将桑叶用于DN处理的活性组分-靶点-通路网络可视化，如图3B所示。与成分与靶点之间的关系相似，每个靶点对应的通路也具有多样性、重叠性和特异性，体现了多成分、多靶标、多途径的特点。

图3 来自DAVID和ClueGo的GO项和KEGG通路的功能富集分析

(A) 来自DAVID的GO项，然后通过ClueGo的功能进行富集，以构建BP、CC和MF网络。(B) 活性成分与其扰动的KEGG通路之间的关系。红色节点表示来自桑叶的活性化合物，绿色节点表示药物-疾病交叉作用靶点，蓝色节点表示DN相关通路。

4. MAF1:1和MAF1:5对DN大鼠病理改变的影响

我们建立了DN大鼠模型，验证桑叶对DN的保护作用，观察到肾组织的组织学变化，并显示在图4中。正常组肾皮质、髓质界限明显，肾小球、肾小管形态正常。与正常组比较，模型大鼠肾小管上皮细胞空泡变性，大量炎症细胞浸润，部分上皮细胞脱落。此外，模型大鼠肾小管间质病理学评分升高。桑叶治疗表现出少量的炎症细胞浸润，肾结构与正常组的肾脏结构类似。各给药组肾小管间质评分均降低。与正常组比较，PAS染色显示模型组肾小球系膜细胞和系膜基质有一定增生，基底膜增厚。各给药组肾小球系膜细胞及系膜基质均未见明显增生，基底膜未见增厚。

图4 桑叶对DN大鼠病理变化的影响

(A)桑叶对肾组织病理学改变的影响(×40，HE染色和PAS染色)。(a.肾小球囊性扩张；b.肾小管上皮细胞部分脱落；c.肾小管变性和扩张)。(B) HE染色中不同组的肾小管间质评分。值表示为平均值±SD (n = 3)。#P < 0.05，##P < 0.01与NG 相比, *P < 0.05,**P < 0.01与MG相比。

5. MAF1:1和MAF1:5对DN大鼠生化指标的影响

空腹血糖（FBG）及相关生化指标结果见表1。与正常组相比，在模型组（P <0.01）中，FBG，丙氨酸转氨酶（ALT），甘油三脂（TG），尿酸（UA），总胆固醇（TC），血清肌酐（SCR），血尿素氮（BUN），高密度脂蛋白（HDL），低密度脂蛋白（LDL），尿素氮（UUN），24h尿定量蛋白（U-TP/24h）显著增加，这表明在DN大鼠中发生了代谢紊乱。桑叶给药可不同程度地恢复这些生化指标。具体而言，与模型组相比，MA和MAF1中的FBG分别明显下降36.57％和40.57％。同时，四种桑叶给药组对ALT，UA，SCR，LDL，U-TP/24H具有显著降低效果。在两个单独的组中，MF对TG、TC、HDL、LDL的抑制作用更明显，而MA对FBG、BUN的抑制作用更明显。在两组联合治疗中，MAF1:5对FBG、TG、TC的抑制作用更为明显。MAF1:5在调节HDL方面优于MA，这意味着联合可能具有协同作用。

表1 血清、尿液中相关生化指标的测定（x±s，n=6）

#P < 0.05, ##P < 0.01,###P < 0.001与NG相比, *P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.001与MG相比, ΔP < 0.05, ΔΔP<0.01，ΔΔΔP <0.001与MA相比。

图5 Western blot检测各组合对肾组织中α-SMA、E-cadherin、TGF-β、smad2、smad3、smad7表达的影响

值表示为平均值±SD (n = 3)。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001与NG相比；*P < 0.05, **P< 0.01, ***P < 0.001与MG相比；ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01，ΔΔΔP < 0.001，与MA或MF组相比。

6. MAF1:1和MAF1:5抑制TGF-β/Smads信号通路的激活

为了验证桑叶对DN的改善作用与肾小球纤维化有关，我们检测了肾组织中α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、smad2、smad3、smad7的表达。由图5可见，与正常组比较，DN大鼠α-SMA、TGF-β、smad2、smad3的表达明显上调，而smad7、E-cadherin的表达明显下调。与模型组相比，MA对α-SMA的抑制作用最为显著，MAF1:1或MAF1:5对α-SMA的抑制作用优于MF。在桑叶给药组中，MAF1:5对E-cadherin的增加作用最为显著。桑叶给药组可逆转TGF-β、smad2、smad3表达增加的趋势。MAF1:5对smad3的调控具有协同作用。与模型组比较，MF、MA、MAF1:1和MAF1:5处理可增加smad7的表达，而MAF1:1和MAF1:5的促进作用优于MA和MF。

图6 Western blot检测各组合对肾组织中wnt2、wnt4、β-catenin、p-SGK-3β表达的影响

7. MAF1:1和MAF1:5抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活

为观察桑叶对Wnt/β-catenin信号通路的影响，我们采用western blotting检测肾组织中Wnt-2、Wnt-4、p-GSK-3β和β-catenin的表达。与正常组比较，模型组大鼠wnt-2、wnt-4、p-GSK-3β和β-catenin的表达均显著升高(图6)。除MF组外，MA、MAF1:1和MAF1:5组wnt-2的表达均呈下降趋势，其中MAF1:1的降低率最大。与其他处理组比较，MA对wnt-4的抑制作用最为显著。同时，MF、MA、MAF1:1、MAF1:5组β-catenin的还原率分别为45.00%、56.92%、59.62%、61.54%。MF和MAF1:5均能降低p- GSK-3β的表达，且MAF1:5的抑制作用强于MF。

图7 正常组(黑色)和模型组(红色)在正负离子模式下采集的血清样本(标号1、2)和尿液样本(标号3、4)的OPLS-DA评分图(A)、S-图 (B)和VIP-图 (C)。正离子模式下得到1和3的标签，负离子模式下得到2和4的标签（C1：R2Y=99%，Q2=93%；C2：R2Y=99%，Q2=93%；C3：R2Y=99%，Q2=90%；C3：R2Y=99%，Q2=91%）。

8. MAF1:1和MAF1:5可恢复DN大鼠代谢异常

UPLC-QTOF/MS用于以正离子和负离子模式收集血清和尿液样品的代谢信息（补充图1）。为了研究模型大鼠代谢产物的整体变化，我们对数据进行了分析，得到OPLS-DA评分图(图7A)、S-plot图(图7B)和VIP分布图(图7C)。OPLS-DA对正常组和模型组的区分较好，提示模型大鼠出现代谢异常。我们根据VIP值进行筛选，从S图中提取了潜在的生物标志物。根据MS/MS谱信息(补充图2)，我们在血清中鉴定出18种内源性代谢物，尿液中鉴定出7种代谢物(表2)。其中，血清中有9种磷脂代谢物，模型组硬脂酰肉碱、甘氨胆酸、3-羟基十六碳二烯酰肉碱、葡糖脱氧胆酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸含量显著升高。DN大鼠尿中鞘氨酸、神经酰胺(d18:0/12:0)和皮质醇明显升高，而N-乙酰-L-酪氨酸、马尿酸、植物鞘氨酸和苯丙氨酸明显降低。

表2 在糖尿病肾病大鼠和正常大鼠血清和尿液中鉴定的潜在生物标志物

为探讨桑叶提取物对DN大鼠的作用及机制，我们采用PLS-DA法观察正常组、模型组和给药组的变化。各给药组的代谢物水平与模型组有显著差异(图8A)，除LysoPC(16:0)和LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))外，各给药组的代谢物水平均不同程度恢复到接近正常组水平(图8B)。与单药组相比，联用组对油酰甘氨酸、神经酰胺(d18:0/12:0)、苯丙氨酸和马尿酸的调控具有协同作用。我们将鉴定出的内源性代谢物输入MetaboAnalyst(http://www.metaboanalyst.ca/)数据库，构建并分析代谢途径。我们选择影响值大于0.10的代谢途径作为潜在的靶途径。如图8C所示，我们发现潜在的代谢物参与花生四烯酸(影响0.31)、苯丙氨酸代谢(影响0.37)、鞘脂代谢(影响0.16)和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(影响0.50)的代谢途径。

图8 桑叶提取物及其组合对DN大鼠代谢物的影响

（A）在正离子模式和负离子模式下从正常组、模型组和治疗组采集的血清和尿液样本的PLS-DA评分图。(B)血清和尿液中鉴定的潜在生物标志物的相对峰面积。所有值均表示为平均值±SD (n = 6)。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001与NG相比；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001与MG相比；ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01，ΔΔΔP < 0.001，与MA或MF组相比。(C)血清和尿液样本的代谢途径分析。a：花生四烯酸代谢，b：鞘脂代谢，c：苯丙氨酸代谢，d：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。

现有研究表明，MA和MF在预防糖尿病发展方面具有极好的潜力。此外，我们之前的研究表明，MA和MF以1:1或1:5的比例组合在体外抗糖尿病的活性优于单独使用两种提取物。在本研究中，我们比较了联用组与单用组对血脂、血糖及代谢产物的调节作用，探讨这两种联用是否对DN大鼠具有保护作用和协同作用。鉴于桑叶成分丰富，DN发病机制复杂，我们首次应用网络药理学探讨了桑叶抗DN的潜在靶点和机制，共发现与DN相关的生物活性成分55个，靶点106个，其中槲皮素、山奈酚和1-DNJ为关键成分。大多数靶点显著富集于代谢途径、胰岛素抵抗、鞘脂信号通路等。桑叶可能具有多成分、多靶点、多途径治疗DN的特点。

我们基于网络药理学预测结果，建立了DN大鼠模型，验证桑叶对其的保护作用。结果发现STZ诱导DN大鼠血清FBG、ALT、UA、TG、TC、HDL、LDL、Scr、BUN水平和尿UUN、u-TP/24h明显升高，HE和PAS染色观察到肾小球系膜基质扩张，这些数据表明DN诱导成功。糖尿病患者血清ALT升高是DN的一个危险因素，而较高水平的血清UA与糖尿病肾病的风险增加和进展有关。TC、TG、HDL和LDL是高脂血症的典型指标，可引起肾小球和肾小管间质损伤的血流动力学变化。据报道，STZ会导致显著的肾功能障碍，这可以通过尿白蛋白、BUN和Scr的增加来证明。在本研究中，MAF1:1或MAF1:5可降低除尿量、BUN、UUN外其他指标的水平，从而预防肾脏损害，改善蛋白质代谢紊乱。MAF1:5对HDL的抑制作用优于MA或MF。

图9TGF-β1受体信号通路和Wnt/β-catenin信号通路参与调节细胞外基质、细胞间黏附及基因表达的调控机制综述

研究证明，TGF-β1介导的Smad信号激活导致DN的典型特‍征包括蛋白尿、肾小球硬化和肾小管间质纤维化。TGF-β1抑制细胞外基质(ECM)的降解，导致肾纤维化。Smads是参与TGF-β介导的细胞内信号转导的下游蛋白，Smad7阻断TGF-β1/Smad信号，而Smad2和Smad3激活ECM组分的启动子，从而增加ECM。此外，α-SMA过表达和E-cadherin表达降低提示DN发生肾EMT。在我们的研究中，MAF1:1和MAF1:5可以通过阻断TGF-β1的升高，逆转α-SMA、smad2、smad3的高表达，防止smad7和E-cadherin水平的降低来减轻DN大鼠的肾损伤。MAF1:5对smad3的抑制作用优于MA或MF，对E-cadherin和smad7的上调作用强于MA或MF。同时，MAF1:1对α-SMA的抑制作用较MF更为显著，对E-cadherin的促进作用优于MA，对smad7的增加优于MA和MF。

与TGF-β1/Smad信号通路的功能类似(图9)，我们在DN患者肾小球和DN动物模型中均发现Wnt/β-catenin信号通路过度激活，导致足细胞损伤，蛋白尿加重。Wnt4在肾小管和肾纤维化诱导的肾小球硬化和蛋白尿的形成中起重要作用。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键下游效应子，被GSK-3β磷酸化。此外，β-catenin的活化足以诱导白蛋白尿。在我们的研究中，MAF1:1和MAF1:5可以抑制DN大鼠wnt2和β-catenin的激活，而MAF1:5可以降低p-GSK-3β的表达，从而防止对肾组织的损伤。MAF1:5对p-GSK-3β的降低效果优于MF。

代谢组学是研究生物体内源性代谢整体变化的系统方法，它反映了受试者的生理和病理状况。在本研究中，代谢组学结果显示模型组中花生四烯酸、甘氨胆酸、二十二碳六烯酸的水平显著增加。花生四烯酸及其代谢物可以调节自由基的产生、炎症、免疫反应，从而调节糖尿病的发病机制。此外，花生四烯酸代谢与Wnt/β-catenin或TGF-β/Smads信号通路之间存在密切联系。此外，研究证明LysoPC和LysoPE均能促进脂肪组织对葡萄糖的利用，改善葡萄糖稳态。LysoPC的紊乱加上花生四烯酸代谢的增加意味着糖代谢中PKC通路的异常激活，最终导致肾损伤。除了LysoPC(16:0)和LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)外，MAF1:1和MAF1:5可以逆转受影响代谢物的变化并使其恢复正常水平。

据报道，鞘脂和神经酰胺与糖尿病肾病的病理状况有关，而长链鞘磷脂和神经酰胺在DN大鼠中显著增加。此外，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的增加与DN风险降低有关。在本研究中，我们发现DN大鼠尿液中的鞘氨醇、植物鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/12:0)显著增加，而苯丙氨酸和n-乙酰-l-酪氨酸显着降低。但MAF1:1和MAF1:5可以让这些代谢物的紊乱重回正轨，这也验证了网络药理学的预测。MAF1:1对神经酰胺(d18:0/12:0)的抑制作用和对苯丙氨酸、马尿酸的促进作用均强于MA或MF。同时，MAF1:5对油酰甘氨酸和苯丙氨酸的增强作用优于MF。

结论

综上所述，我们采用网络药理预测、动物体内验证和代谢机制研究的分步方法，构建桑叶抗DN的多组分-靶标-通路调控网络。本研究发现MAF1:1和MAF1:5可能与MF或MA单独作用一样，通过控制血糖和血脂，抑制Wnt/β-catenin和TGF-β/Smads信号通路，调节花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢、鞘脂代谢，从而减轻肾损伤。此外，MAF1:1和MAF1:5可能通过多靶点、多途径对DN大鼠产生协同作用。这些发现清楚地表明，整合网络药理学和代谢组学分析为了解桑叶治疗DN的复杂机制提供了更好的方法。为了进一步阐明这两种组合对DN的协同作用，我们未来需要研究药物的体内吸收和代谢。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378874122000605

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