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导读

陈皮（CP）具有多种保健功效，不仅是我国著名的中草药之一，也是发酵食品的主要成分之一。本研究通过代谢组学和体外生物活性分析，比较了贮藏年限(1、3、4、5、6和11年)对CP化学谱和潜在生物活性化合物的影响。随着贮藏时间的延长，橙皮苷的含量显著降低，而川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮和桔皮素的含量增加，同时，CP的抗氧化活性增强。酚酸类、黄酮醇苷类、脂肪酸类和烷基苷类是区分CP贮存时间的标志化合物。相关分析表明，槲皮素-葡萄糖苷、奎尼酸、三羟基二甲氧基黄酮和芦丁等多酚类化合物是CP中潜在的抗氧化成分。二氯甲烷和正丁醇组分表现出较好的抗氧化能力和对葡萄糖水解酶的抑制作用，它们主要含有阿魏酸、川陈皮素、3,5,6,7,8,3,4-七甲氧基黄酮、山奈酚和橙皮苷。

论文ID

原名：Chemical Variation of Chenpi (Citrus Peels) and Corresponding Correlated Bioactive Compounds by LC-MS Metabolomics and Multibioassay Analysis

译名：LC-MS代谢组学和多生物活性分析陈皮及其相关活性化合物的化学变化

期刊：Frontiers in Nutrition

IF：6.576

发表时间：2022.02

通讯作者：伍振峰&张梁

通讯作者单位：江西中医药大学&安徽农业大学

实验设计

实验结果

1. 不同贮藏年限CP中PMFs的含量

根据前人的研究，多甲氧基类黄酮（PMF）是CP中的主要成分，因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定了CP中橙皮苷、川陈皮素、3,5,6,7,8,3 ’,4’-七甲氧基黄酮和桔皮素4种PMF在贮藏过程中的含量。如图1A所示，在优化的色谱条件下，4种PMFs在反相洗脱体系中具有良好的选择性，其中橙皮苷由于其糖苷结构，相对于其他标准品保留时间最短，这与之前的研究结果一致。此外，如图1B所示，这四种PMFs也具有良好的选择性，其余大部分未知峰均采用LC-MS进行定性分析。

图1 四种分析物(A)和CP样品(B)的HPLC图

我们在5-200μg/mL浓度范围内建立了6个浓度水平的校正曲线。校准曲线的线性度和相关系数r如表1所示。这些校正曲线的相关系数为0.9999，说明这些校正曲线具有良好的线性关系。

表1 用HPLC测定了四种黄酮类化合物的含量

贮藏一段时间后，CP具有独特的风味和一些健康益处。同时，贮藏过程中CP的化学成分也发生了一些变化，可能会影响某些生物活性。如表2所示，我们利用主要化合物的校正曲线，测定了不同贮藏年限CP中四种黄酮类化合物的变化。贮藏4年的CP中橙皮苷、川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮和桔皮素的含量高于其他贮藏年。但随着贮存时间的延长，这四种PMF的含量略有下降，说明CP至少需要4年的贮存时间，其中橙皮苷在贮藏过程中发生了显著变化，例如，其含量在短时间贮藏（4年贮藏）后略有增加，而在长时间贮藏后则显著下降。贮藏11年后，橙皮苷含量为8.98±1.80 mg/g，甚至低于贮藏1年后的13.05±0.71 mg/g。然而，需要进一步的研究来确定这些PMF在贮藏期间在CP中的转化机制，以及这些变化对生物活性的影响。

表2 不同贮藏年限(1、3、4、5、6和11年)CP中四种黄酮类化合物含量(mg/g)

经单因素方差分析(Tukey '乘法比较检验)，同一行上标不同字母表示差异有统计学意义(p < 0.05)的化合物含量。

2. 基于LC-MS的非靶向代谢组学分析结果

将原始MS数据上传到MS-DIAL进行处理，然后通过SIMCA-P进行分析。虽然主要的PMF变化不规律，但聚类分析将这些样本分为两组，一组为1Y和3Y，另一组为4Y、5Y、6Y和11Y(图2A)。如图2B所示，样本之间的空间距离越近，样本越相似，距离越远，差异越大。主成分分析的得分图表也显示了相同的结果。如图2C、E所示，我们建立了PLS-DA模型(R2X=91.3%， R2Y=98.5%， Q2=97.5%)和OPLS-DA模型(R2X=91.3%， R2Y=98.3%，Q2=96.7%)。500次位移试验的交叉验证表明，模型是可靠的(图2D,F)。然后我们确定CP成分与贮存时间作为连续Y变量的相关性，建立了PLS线性模型(图2G,H)。

为了探索不同年份CP的分类标记化合物，我们对S-plot图谱进行了分析。如图3A所示，许多红点表示p[1]值高，这意味着从数据集转移。它还列出了每个标记化合物对生物活性的贡献顺序(图3B)，主要有天冬氨酸、甲基柠檬酸、十七碳三烯酸和地奥司明。

图2 基于LC-MS的不同贮藏年限CP代谢组学数据的多因素分析。聚类分析(A)；主成分分析得分图(B)；偏最小二乘数据分析(PLS-DA)(C)；PLS-DA排列检验结果(D)；正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)(E)；OPLS-DA排列检验结果(F)；贮藏年限预测的偏最小二乘回归模型(G)；PLS的排列试验结果(H)。

图3 不同贮藏年限下CP样品的S-plot图(A)和抗高血糖和抗氧化活性贡献值的排序(B)

3. 不同贮藏年限CP分类标志化合物的鉴定

为了鉴定这些标记化合物，我们采用了两种方法来分析它们的化学结构。首先，用标准品对标记物进行鉴定，该方法是最可靠的化合物鉴定方法。其次，对质谱离子(MS/MS离子)进行分析，找出典型化合物的解离规律。在鉴定过程中，这些方法被联合用于确定标记化合物的结构。表3列出了47个区分不同年份CP的标记化合物，并给出了高分辨率m/z和MS/MS结果(补充图1)。

VIP值为各化合物的贡献值，其含量在贮藏过程中变化显著。正如我们之前在茶叶贮藏方面的研究，脂肪酸在不受控制的条件下容易贮藏。在表3中，大多数脂质是通过参考LIPID MAPS数据库初步鉴定出来的。这些脂质通常有较长的滞留时间，并表现出规律性的大块碎片调节。此外，一些羟基肉桂酸是标记化合物，这可能是由酚酸在贮藏过程中水解积累的。黄酮类醇苷和PMFs作为CP的主要化合物，是标志化合物，主要包括芦丁、柚皮素、山奈酚、四羟基二甲氧基黄酮HMG-糖苷和芹菜素-6,8-di-C-吡喃葡糖苷。

表3 关键的代谢物负责区分CP的储存年限

4. 不同贮藏年限CP的抗氧化活性

每种测定抗氧化能力的方法都有其局限性，并可能导致偏差。因此，在评价抗氧化能力时，单一的测量方法并不是完美的。本文采用三种方法相结合的方式研究了CP的抗氧化能力。IC50值越小，其清除能力和抗氧化能力越强。如图4所示，6种CP样品的抗氧化活性不同。

自由基清除剂能捕获DPPH的单电子，使其颜色变浅，最大吸收波长线性减小。光吸收值降低，说明抗氧化能力增强，从而评价测试样品的抗氧化能力。由图4A可知， DPPH自由基清除活性的IC50由高到低依次为：1.529±0.023 mg/mL(1年)、1.132±0.123 mg/mL(4年)、0.963±0.100 mg/mL(3年)、0.842±0.137 mg/mL(6年)、0.736±0.062 mg/mL(11年)、0.734±0.038mg/mL(5年)。因此，贮藏5年的CP的抗氧化能力最强，贮藏11年的CP次之，贮藏1年的CP的抗氧化能力最差。在之前的一项研究中，水果、蔬菜和其他植物在低温下贮藏更长时间后，抗氧化能力通常会增加，这种增加可能与抗氧化化合物的增加有关。本研究中抗氧化活性化合物主要包括多酚类、脂肪酸类、有机酸类和氨基酸类。

2,2- 叠氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）与过氧化氢和过氧化物酶形成ABTS+， ABTS+与铁-肌红蛋白混合物的最大吸收波长分别为820 nm、734 nm和650 nm。在氢供体的存在下，混合物在最大吸收波长处的OD值降低。抗氧化剂的抗氧化能力直接影响OD值的下降程度，因此OD值的下降程度可以反映抗氧化能力。如图4B所示，ABTS自由基清除活性IC50由高到低依次为：61.86±4.41 mg/mL(4年)、61.36±3.34 mg/mL(3年)、57.503±1.588 mg/mL(6年)、50.277±3.301mg/mL(5年)、46.763±4.631 mg/mL(1年)、32.797±2.405 mg/mL(11年)。因此，贮藏11年的CP的抗氧化能力最强，贮藏1年、5年、6年、3年和4年的CP的抗氧化能力次之。这些结果表明，贮藏过程中CP化学成分的变化影响了其抗氧化能力。

铁离子还原法（FRAP）的原理是Fe3+-三吡啶三嗪(TPTZ)在593 nm处有最大的吸收峰，在抗氧化物质的作用下还原成Fe2+形式，呈蓝色，吸收值增大。FRAP值越大，抗氧化剂的还原能力越强。根据提取液的吸光度，我们通过校准曲线可以计算出相应的Fe2+浓度，从而得到CP的抗氧化能力。如图4C所示，总黄酮对CP铁离子的还原能力随着贮藏年限的增加呈现出显著的增加趋势，说明贮藏11年的CP具有最强的抗氧化能力。

由于CP中含有丰富的类黄酮，其抗氧化活性也高于其他水果或植物。从表2中可以看出，随着贮藏时间的延长，黄酮类化合物的含量总体上有所增加，因此CP(11年)的抗氧化活性最高。此外，CP中可能还有其他化合物，如酚类、有机酸等，对活性也有贡献。

图4 DPPH(A)、ABTS(B)和FRAP(C)对不同CP抗氧化活性的影响，不同字母表示差异有统计学意义(p＜0.05)，单因素方差分析

5.不同贮藏年限CP对α淀粉酶和α葡萄糖苷酶活性的抑制作用

α 葡萄糖苷酶活性的实验原理是α葡萄糖苷酶与PNPG反应生成对硝基苯酚。当样品溶液加入到体系中，样品溶液中α葡萄糖苷酶的活性受到抑制，同时产生的对硝基苯酚量减少，导致光吸收值下降。由图5A可知，α葡萄糖苷酶的IC50抑制活性由高到低依次为：1.039±0.022mg/mL(6年)、0.911±0.045 mg/mL(1年)、0.778±0.027 mg/mL(11年)、0.641±0.069 mg/mL(4年)、0.591±0.030 mg/mL(5年)、0.460±0.007 mg/mL(3年)。因此，贮藏3年的CP对α葡萄糖苷酶的抑制能力最强，5、4、11、1和6年的贮藏时间次之，且贮藏6年的CP对α葡萄糖苷酶的抑制能力最差。

根据α淀粉酶裂解淀粉生成还原糖，与DNS溶液反应生成深色化合物的原理，我们测定了α淀粉酶活性。当样品溶液加入到体系中，α淀粉酶活性受到抑制，同时还原糖量也受到抑制，导致光吸收下降。由图5B可知，α淀粉酶的IC50抑制活性由高到低依次为：50.457±1.941 mg/mL(4年)、46.687±0.831 mg/mL(6年)、26.653±1.000 mg/mL(11年)、15.897±0.609 mg/mL(3年)、11.537±1.289 mg/mL(5年)、11.250±0.941mg/mL(1年)。因此，贮藏1年的CP对α淀粉酶的抑制能力最强，5、3、11、6和4年的贮藏时间次之，贮藏4年的CP对α淀粉酶的抑制能力最差。

图5不同浓度的CP样品对α葡萄糖苷酶(A)和α淀粉酶(B)的抑制作用及其IC50值，柱的不同字母表示差异有统计学意义(p＜0.05)，单因素方差分析。

研究分析表明，抑制消化酶活性的能力与不同贮藏年限之间没有一定的相关性。除贮藏年限外，CP的抗消化酶能力也与果树生长环境、采收方式和加工方式密切相关。我们对6个样品进行Pearson相关性分析，确定标记物与抗氧化活性/降血糖活性之间的关系，Pearson相关系数列于表4。

槲皮素-葡萄糖苷、奎尼酸、三羟基二甲氧基黄酮和羟基二甲氧基苯基丙酸是与抗氧化活性呈正相关的标志化合物。化合物与α葡萄糖苷酶/α淀粉酶间Pearson相关系数为≥0.5，显示出抑制酶活性的潜在能力。

表4 标记物抗氧化能力的Pearson相关系数及对α葡萄糖苷酶/α淀粉酶的抑制作用

6. CP不同馏分中PMFs的含量

我们采用建立的校正曲线测定了CP四种不同馏分中四种黄酮类化合物的含量，结果表明, 橙皮苷在正丁醇中含量丰富、川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮和桔皮素在二氯甲烷中含量丰富，川陈皮素在二氯甲烷中的含量远远高于在其他馏分中，如表5所示。

表5 CP提取物不同馏分4种黄酮类化合物的含量

N.D.表示未检测。

7. CP不同馏分提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

结果表明，CP石油醚馏分对α葡萄糖苷酶无明显抑制活性，每个馏分抑制α糖苷酶活性的能力依次为：正丁醇＞水＞二氯甲烷＞乙酸乙酯＞石油醚。在相同浓度下，正丁醇馏分的抑制率明显高于其他馏分，如图6A所示。正丁醇馏分的IC50值为1.75 mg/mL，二氯甲烷馏分、乙酸乙酯馏分和水馏分的IC50值分别为9.55、16.84和8.61 mg/mL，说明不同馏分的活性存在显著差异。

石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯馏分对α淀粉酶无明显抑制活性，正丁醇和残留馏分对α淀粉酶有明显抑制活性。在相同浓度下，正丁醇馏分的抑制率明显高于其他馏分，如图6B所示。残液的IC50值为25.22 mg/mL，正丁醇馏分的IC50值为101.10 mg/mL。因此，α淀粉酶的抑制主要是由亲水分子引起的。

图6 CP不同馏分对α葡萄糖苷酶(A)和α淀粉酶(B)的抑制作用及其IC50

8. CP不同馏分的抗氧化活性研究

由图7A可知，正丁醇馏分清除DPPH自由基的能力最强，IC50值为5.12 mg/mL，而石油醚馏分清除DPPH自由基的能力最差。各馏分清除DPPH自由基的能力依次为：正丁醇＞乙酸乙酯＞二氯甲烷＞水＞石油醚。表5明显显示抗氧化活性应该归因于橙皮苷。

清除ABTS自由基的实验结果表明，各馏分均无ABTS抗氧化能力。各馏分黄酮类化合物含量较低，各馏分含量均为200 mg/mL。不同年份CP对ABTS清除能力的IC50为32.80±61.87 mg/mL，表2所示的另一证据表明，黄酮类化合物清除ABTS自由基的浓度阈值应远高于表5所示不同馏分的黄酮类化合物浓度。

不同馏分的Fe2+还原能力不同，如图7B所示，依次为：正丁醇＞乙酸乙酯＞二氯甲烷＞水比＞石油醚，其中石油醚馏分的还原能力几乎为0。这一顺序与DPPH自由基清除能力表现出相同的趋势，这也与分布在不同部位的黄酮类化合物含量密切相关。

尽管我们采用了三种不同的抗氧化生物测定平台，但在所有5种馏分(石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇和水)中，正丁醇馏分始终是抗氧化剂最多的。黄酮类化合物在CP中含量丰富，并以具有抗氧化作用而闻名。在本研究中，我们只讨论了4种PMFs(橙皮苷、川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮和桔皮素)随时间延长的趋势。尽管如此，在CP中可能还有其他化合物对这种活性有贡献。因此，在表6中，我们主要从二氯甲烷馏分中鉴定出11个化合物，正丁醇馏分中鉴定出14个化合物，其中香草酸、阿魏酸等化合物具有较好的抗氧化活性。

图7 DPPH (A)和FRAP(B)对CP不同馏分抗氧化活性的影响

9. 用HPLC-DAD-Q-TOF-MSn鉴定正丁醇和二氯甲烷馏分中的生物活性化合物

由于二氯甲烷的含量和正丁醇的活性均高于其他馏分，因此将这两个馏分用于LC-MS/MS分析和结构分析。结果见表6，两组分的色谱图见图8。二氯甲烷馏分主要含有阿魏酸、川陈皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮，正丁醇馏分主要含有山奈酚和橙皮苷。

表6 CP的二氯甲烷和正丁醇馏份的主要化合物的鉴定

图8 二氯甲烷(A)、正丁醇馏分(B)、二氯甲烷(C)、正丁醇馏分(D)的HPLC谱图

结论

本文提出了一种结合代谢组学分析、抗氧化能力和消化酶抑制实验的方法来评价不同贮藏年限CP的质量，并鉴定潜在的活性成分。非靶向代谢组学分析结果显示，不同贮藏年限CP间存在显著差异，从CP中鉴定出47种不同化合物，主要包括黄酮类化合物、羟基肉桂酸、氨基酸和脂肪酸，但不同贮藏年限CP的定量分析没有表现出一定的规律。通过本研究，我们可以了解影响CP质量的复杂内部机制，但需要进一步研究来揭示确切的机制。

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2022.825381/full

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