武汉大学黄卫华最新JACS：纳米电化学传感器检测吞噬溶酶体内ROS/RNS!|pt|ros|武汉大学|电化学|细胞

研究内容

活性氧和活性氮(ROS/RNS)是由巨噬细胞吞噬溶酶体产生的。这种产物对吞噬受损细胞和病原体至关重要，即保护机体和维持免疫稳态。以亚毫秒分辨率定量和单独监测四种主要的ROS/RNS (ONOO-, H2O2, NO和NO2-)是必要的，以阐明它们快速生成的机制，追踪吞噬溶酶体内ROS/RNS浓度随时间的变化，特别是，证明吞噬过程中ROS/RNS稳态的来源。

武汉大学黄卫华教授课题组和厦门大学、PSL Research University, Sorbonne University的Christian Amatore教授专门研制了一种新型的、专门设计的纳米线电极(SiC@Pt NWEs)。电极是由SiC纳米线和一层3 nm铂纳米颗粒(Pt NPs)涂层组成，其高电催化性能可对四个主要的ROS/RNS进行表征和单独测量。首次实现了对单个休眠吞噬酶体中ROS/RNS的定量、选择性和统计稳健性测定。相关工作以“Homeostasis inside Single Activated Phagolysosomes: Quantitative and Selective Measurements of Submillisecond Dynamics of Reactive Oxygen and Nitrogen Species Production with a Nanoelectrochemical Sensor”为题发表在Journal of the American Chemical Society上。

研究要点

要点1.作者发展了一种用Pt纳米颗粒包裹SiC纳米线的新型电极(SiC@PtNWEs)，展现出高的电催化活性和选择性，研究了活化的活巨噬细胞内产生的四种主要ROS/RNS(即ONOO-、H2O2、NO和NO2-)的亚毫秒动力学。在小鼠RAW 264.7巨噬细胞的单个激活吞噬酶体中发生的快速稳态过程中，可以单独监测这些反应物种的通量。

要点2.实验结果表明，在持续的炎症情况下，吞噬酶体主要产生ONOO-、NO和NO2-，产量大致相等。相比之下，只产生少量的H2O2，这与一般的医学和生物学观点相反。然而，当吞噬酶体必须补偿其体内ROS/RNS含量的突然下降时，一种复杂的稳态机制被触发，试图补偿ROS/RNS的损失。然后在亚毫秒的时间范围内产生强烈的ROS/RNS爆发，但其组成完全不同，主要涉及ONOO-和大量过量的NO。

要点3.这些对比结果首次揭示了当吞噬酶体从持续的炎症状态转变为稳态状态时，NOX(主要生成超氧离子)和iNOS(主要生成一氧化氮)酶池相对活性的急剧变化。尽管出乎意料，酶相对活性的这种剧烈变化似乎是突然提高病原体清除率的最佳解决方案，而不会过度产生破坏性的ROS/RNS，从而危及吞噬酶体和巨噬细胞本身。

这项工作中提出的电化学策略的未来发展无疑将为允许吞噬作用的复杂机制提供深入的定量理解。由于巨噬细胞作为抵御疾病、细菌、病毒、突变细胞等的多功能第一道防线的至关重要的作用，相信对这种详细的定量知识的探索是完全合理的。

研究图文

图1. SiC@Pt NWEs用于单个吞噬酶体中ROS/RNS定量分化的示意图。(A) SiC@Pt NWs两步化学电镀。(B)在纳米探针尖端安装SiC@Pt NWs，用于细胞内四种主要ROS/RNS (ONOO-，H2O2, NO和NO2-)在四种不同电化学电位下的差分测量。

图2. (A) SiC@Pt NWs的SEM; 插图: 放大的SEM。(B) SiC@Pt NW边缘的TEM; 插图: 红色区域的Pt NPs的HRTEM。(C) SiC@Pt NWE的SEM; 插图: 绝缘部分尖端暴露部分(半径约160nm)的放大SEM。(D) 未经处理, 绝缘和尖端暴露的SiC@Pt NEW电极在1 mM Ru(NH3)63+/-1 M KCl中的CV曲线。确定Ru(III)的还原电流分别降低了98%和60%(n=5)。(E) 尖端暴露的SiC@PtNEW电极在1 mM Ru(NH3)63+/-1 M KCl中重复的CVs(100循环)。(F) PBS溶液中ONOO-(蓝色曲线，1mM, pH=10.0)、H2O2(橙色曲线，1 mM, pH=7.4)、NO(绿色曲线，1 mM, pH=7.4)和NO2-(紫色曲线，1 mM, pH=7.4)的伏安氧化; 电流被标准化到它们的最大值。垂直虚线表示每个ROS/RNS物种的最佳检测电位。

图3. (A)将SiC@Pt NWEs插入IFN-γ/LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞后，在(A)+800，(b)+600，(c)+500，(d)+500mV+CAT条件下记录的代表性安培曲线。在每个曲线中用星号标记的事件以高分辨率显示(红色星号表示带肩的尖峰，黑色星号表示正常的IVIEC尖峰)。(B)归一化对数正态直方图(log10Q)描述了在不同电位下检测到的电荷值的频率分布(紫色，+800 mV, n=416，来自20个细胞; 绿色，+600 mV, n=425，17个细胞; 橙色，+500 mV, n=403，15个细胞; 蓝色，+500 mV+CAT, n=418，20个细胞)。(C)不同电位下log10Q的统计分析(平均值±SEM;单因素方差分析，**p≤0.01，*p≤0.05)。(D)四种主要ROS/RNS与其前体O2·−和NO之间的化学关系示意图。每种物质(n)的平均含量在括号内。

图4. (A)正常尖峰和带肩的尖峰的比例记录与检测电位的函数。(B)在一次IVIEC活动中，使用单个SiC@PtNWE对单个吞噬酶体释放的初始和新产生的ROS/RNS进行定量监测的原理。描述不同电位下检测到ROS/RNS的初始电荷Q0 (C)和新产生电荷Qprod (F)的对数正态分布频率的归一化直方图(紫色，+800 mV, n=316，20个细胞;绿色，+600 mV, n=279，17个细胞; 橙色，+500 mV, n=43，7个细胞; 蓝色，+500 mV+CAT, n=35，10个细胞)。不同电位下检测到的ROS/RNS初始电荷Q0 (D)和新产生电荷Qprod (G)的对数统计分析(平均值±SEM; 单因素方差分析，***p≤0.001，**p≤0.01，*p≤0.05,n.s.: 不显著)。在M1 RAW 264.7巨噬细胞中根据初始吞噬酶体含量(E)或新鲜产生的吞噬酶体(H)观察到的4个主要检测到的ROS/RNS及其前体O2·−和NO之间的化学关系的概述方案。

图5. 四种主要ROS/RNS (H2O2，ONOO-，NO和NO2-)及其两种前体(O2·−和NO)在(A)全局含量(储存+稳态)，(B)储存数量(电流峰值的正常“IVIEC成分”)和(C)稳态阶段新产生的(“肩部成分”)中的相对比例。(D)与检测到的ROS/RNS数量相关的可能机制的图形摘要(与四种主要ROS/RNS相关的色斑的相对直径表示它们的相对检测数量; 箭头的厚度表示吞噬酶体内发生反应的相对动力学大小)。

文献详情

Homeostasis inside Single Activated Phagolysosomes: Quantitative and Selective Measurements of Submillisecond Dynamics of Reactive Oxygen and Nitrogen Species Production with a Nanoelectrochemical Sensor

Yu-Ting Qi, Hong Jiang, Wen-Tao Wu, Fu-Li Zhang, Si-Yu Tian, Wen-Ting Fan, Yan-Ling Liu, Christian Amatore,* Wei-Hua Huang*

J. Am. Chem. Soc.

DOI: 10.1021/jacs.2c01857

作者简介

黄卫华，男，武汉大学化学与分子科学学院教授，博士生导师，武汉大学珞珈特聘教授，国家杰出青年科学基金获得者，国家“万人计划”科技创新领军人才。分别于1996与2002年在武汉大学获得学士和博士学位，然后留校任教。2005年3月到2006年3月在法国巴黎高师(ENS)从事博士后研究，2007年11月晋升为教授。

从事生命分析化学研究，主要研究方向为单细胞分析、生物电分析化学以及微流控芯片。先后主持8项国家自然科学基金项目，作为研究骨干参与国家自然科学基金委创新研究群体、973等多个国家级科研项目。迄今已在Angew. Chem. Int. Ed.,JACS,Chem. Sci.,Anal. Chem.等学术刊物发表SCI论文120余篇，参与主编专著1部。2004年获湖北省自然科学一等奖（第二完成人），2008年获首届武汉市青年科技奖，2009年入选教育部“新世纪优秀人才支持计划”，2017年获“国家杰出青年科学基金”资助，2019年入选第四批国家“万人计划”科技创新领军人才