近年来，随着各种动物模型的发展，对长期、高速的活体荧光成像以观察其原生状态下的细胞间和细胞内相互作用的需求迅速增长。与传统的活体显微镜相比，具有数字自适应光学系统的扫描光场显微镜 (sLFM) 通过以断层摄影方式对整个体积进行成像，提供了一种紧凑的计算解决方案，时空分辨率提高了几个数量级，并且光毒性降低了。

近期，清华大学戴琼海及吴嘉敏共同通讯在Nature Protocols（IF=17）在线发表题为“A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics”的研究论文，该研究提出了一个分步方案，用于通过使用现成的镜头和设备以低成本将多色 sLFM 的硬件和软件实现作为普通宽视场荧光显微镜的附加组件。该过程可以很容易地应用于其他 LFM 变体，这在某些实验环境中可能是有利的。

由于 sLFM 对高质量数据的算法后处理的强烈依赖，该方案描述了用于校正和性能优化的各种人工制品和相应的参数。为了增加对系统未对准和器件制造差异的容限，该研究描述了一种一步校准方法，可实现高达衍射极限的稳健成像性能。该研究提供了一个开源图形用户界面，用于硬件同步和多视图图像的实时操作。具有光学和电子学基础知识的整个过程，包括光学设置、软件安装、系统校准和 3D 重建，可在 3-4 d 内完成。

另外，2022年3月28日，UCSF的Lani F. Wu，Steven J. Altschuler及清华大学戴琼海（共同一作为鲍峰和Yue Deng）共同通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为“Integrative spatial analysis of cell morphologies and transcriptional states with MUSE”的研究论文，该研究提出了多模式结构化嵌入 (MUSE)，这是一种通过整合形态学和空间分辨的转录数据来表征细胞和组织区域的方法。该研究证明 MUSE 可以发现任一模态遗漏的组织亚群，并补偿特定于模态的噪声。该研究将 MUSE 应用于包含空间转录组学（seqFISH+、STARmap 或 Visium）和成像模式的各种数据集。MUSE 确定了健康大脑皮层和肠道组织中具有生物学意义的组织亚群和定型空间模式。在患病组织中，MUSE 揭示了与肿瘤区域接近的基因生物标志物以及阿尔茨海默病脑区淀粉样前体蛋白加工的异质性。MUSE 能够整合多模态数据，从而深入了解复杂生物组织中细胞的状态、功能和组织。

2021年8月16日，清华大学戴琼海，方璐及王好谦共同通讯在Nature Methods 在线发表题为”Reinforcing neuron extraction and spike inference in calcium imaging using deep self-supervised denoising“的研究论文，该研究开发了 DeepCAD，这是一种自我监督的深度学习方法，用于钙成像数据的时空增强，不需要任何高信噪比 (SNR) 观察。DeepCAD 抑制检测噪声，将信噪比提高十倍以上，从而增强了神经元提取和尖峰推理的准确性，并促进了神经回路的功能分析。

2021年5月25日，清华大学戴琼海，俞立及范静涛共同通讯在Cell 在线发表题为”Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale“的研究论文，该研究提出了一种计算成像框架，称为数字自适应光学扫描光场相互迭代层析成像（DAOSLIMIT），它具有高速，高分辨率3D成像，平铺波前校正和紧凑型系统的低光毒性。通过同时对整个体积进行层析成像，该研究获得了在225×225×16μm3范围内的体积成像，在数十万个时间点上，毫秒级的横向分辨率高达220 nm，轴向分辨率高达400 nm。为了建立功能，该研究探索了中性粒细胞迁移和肿瘤细胞循环过程中不同物种的大规模细胞迁移和神经活动，并观察了哺乳动物的各种亚细胞动力学。

2021年1月21日，中国科学院生物物理研究所李栋及清华大学戴琼海共同通讯在Nature Methods 在线发表题为“Evaluation and development of deep neural networks for image super-resolution in optical microscopy”的研究论文，该研究使用多模态结构照明显微镜 (SIM)，首先提供了一个广泛的 LR-SR 图像对数据集，并在结构复杂性、信噪比和放大因子方面评估了深度学习 SR 模型。其次，该研究设计了深度傅立叶通道注意网络 (DFCAN)，它利用不同特征之间的频率内容差异来学习有关不同生物结构的高频信息的精确分层表示。第三，该研究展示了 DFCAN 的傅立叶域聚焦能够在低信噪比条件下稳健地重建 SIM 图像。该研究证明，在多色活细胞成像实验中，DFCAN 在 10 倍以上的持续时间内实现了与 SIM 相当的图像质量，这揭示了线粒体嵴和类核的详细结构以及细胞器和细胞骨架的相互作用动力学。

由于 3D 微环境的参与和不同细胞的相互作用，细胞和细胞器在细胞培养板和多细胞生物中表现出非常不同的行为。更重要的是，它们的功能和行为通常在不同的生理或病理状态下长时间表现出快速波动。然而，成像组织涉及光散射、光学像差、3D 样品运动和光毒性等挑战，所有这些都极大地降低了当前显微镜在复杂环境中的成像性能，尤其是在哺乳动物中。这些挑战限制了细胞和细胞器在其天然状态下的时空异质性研究，例如胚胎发育、肿瘤转移、免疫反应和神经回路活动。

为了打破活体成像的这些障碍，最近开发了一种具有数字自适应光学 (DAO) 计算框架的扫描光场显微镜 (LFM) (sLFM) 方法，它允许使用简单紧凑的系统在毫秒级对哺乳动物进行长达一小时的 3D 亚细胞成像。该方法名为“DAOSLIMIT”。LFM 不是像传统显微镜那样逐层捕获 3D 信息，而是通过微透镜阵列 (MLA) 以断层摄影方式同时对整个 3D 体积进行成像，这有助于以低光毒性进行高速 3D 成像。由于其紧凑的系统，LFM 在以单细胞分辨率记录大规模神经活动方面取得了成功。

DAOSLIMIT 工作流程概述（图源自Nature Protocols ）

近年来，人们提出了各种硬件和软件方法，通过提高分辨率、抑制背景荧光、增加数据吞吐量、降低重建伪影和计算成本来提高 LFM 的实际性能。然而，由于空间分辨率和角度分辨率之间的内在权衡，LFM 在不牺牲景深 (DOF) 的情况下实现的分辨率远低于整个物镜数值孔径 (NA) 的衍射极限。这种分辨率远远不足以成像亚细胞结构，并限制了 LFM 在细胞生物学、发育生物学、免疫学和肿瘤学中的广泛应用。sLFM 通过使用 2D 扫描系统定期漂移图像平面来解决这一难题，并将分辨率提高到衍射极限，同时保持高速和低光毒性。

此外，凭借高分辨率的空间角度信息，sLFM 可以估计和校正后处理中的空间非均匀像差，而无需额外的波前传感器和空间光调制器 (SLM)。紧凑的系统、DAO 功能和适当的数据处理管道使 sLFM 对环境和系统对齐的波动非常稳健。研究人员已经证明了 sLFM 在之前的工作中对不同物种的细胞和亚细胞行为进行活体研究的优势。

DAOSLIMIT 示意图（图源自Nature Protocols ）

为了进一步促进其在没有光学专家的生物实验室中的广泛应用，该研究提出了一个分步方案，用于通过使用现成的镜头和设备以低成本将多色 sLFM 的硬件和软件实现作为普通宽视场荧光显微镜的附加组件。该过程可以很容易地应用于其他 LFM 变体，这在某些实验环境中可能是有利的。

由于 sLFM 对高质量数据的算法后处理的强烈依赖，该方案描述了用于校正和性能优化的各种人工制品和相应的参数。为了增加对系统未对准和器件制造差异的容限，该研究描述了一种一步校准方法，可实现高达衍射极限的稳健成像性能。该研究提供了一个开源图形用户界面，用于硬件同步和多视图图像的实时操作。具有光学和电子学基础知识的整个过程，包括光学设置、软件安装、系统校准和 3D 重建，可在 3-4 d 内完成。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41596-022-00703-9