撰文 | 木兰之枻

CRISPR-Cas系统给基因编辑研究带来了巨大变革，由此衍生的单碱基编辑器ABEs和CBEs分别能实现A-G和C-T的精准突变，在多种点突变相关的遗传病治疗中具有巨大的临床应用潜力。目前阻碍CRISPR-Cas及单碱基编辑器应用的最大挑战之一是“体型”过大。近年来研究者通过演化分析，发现多种超迷你核酸酶系统如Cas12f、TnpB和IscB，其体积约400~500氨基酸，且在体外具有PAM依赖的双链DNA切割活性，这让研究者看到了摆脱“体型”困扰推动基因编辑的契机【1-3】（详见BioArt报道：Nature | 基因编辑工具箱或再添神器——TnpB核酸内切酶；Science | 张锋团队再发文：源于IS200/605转座子家族的多种核酸酶或可成为基因编辑新工具）。2021年，多名研究者通过gRNA改造和蛋白优化，成功获得可在哺乳动物细胞内进行高效基因编辑的Cas12f工具【4-6】（详见BioArt报道：NBT | 超迷你CRISPR系统Cas12f，让基因编辑摆脱“体型”困扰；Nat Chem Biol | 季泉江团队开发极小型CRISPR-Cas12f基因编辑工具；Cas12f第三弹！Mol Cell | 亓磊组开发超微型多功能CRISPR-Cas系统CasMINI）。不过目前关于小型化单碱基编辑器的研究仍非常有限，其中Cas12f衍生而来的迷你ABEs系统编辑效率最高不足10%，需要进一步的改进和优化。

2022年8月1日，来自韩国生命工学研究院的Yong-Sam Kim实验室在Nature Chemical Biology发表题为Hypercompact adenine base editors based on transposase B guided by engineered RNA的论文。文章在2021年Cas12f gRNA改造的基础上，进一步优化与Cas12f高度同源的TnpB核酸酶，成功开发出超迷你单碱基编辑器TaRGET-ABE，并实现了细胞和动物体内的A-G精准编辑。此外，研究者还通过蛋白突变筛选，扩充了TnpB的PAM限识别位点并拓展了TaRGET-ABE的活性窗口，为新工具的临床应用提供了更多保障。

研究者在前期工作中发现，gRNA改造能有效提升Cas12f在哺乳动物细胞内的基因编辑效率。从演化角度而言，Cas12蛋白家族很可能源自TnpB家族，其中乌斯古菌门来源的TnpB与已报道的Cas12f高度同源。因此研究者推测Cas12f的改造gRNA或可与TnpB联用从而实现高效的基因编辑。HEK293T细胞中的验证实验也证实， Cas12f 改造后的gRNA与TnpB非常契合，两者联用能实现多个位点的高效基因编辑，之后该系统被命名为TaRGET并用于后续研究。

随后研究者设计出TnpB的失活突变体dTnpB（D354A），并与脱氨酶Tad二聚体融合以构建功能性的迷你ABEs。通过不同的组合筛选研究者发现，将Tad二聚体融合于dTnpB的C末端可获得功能性的迷你ABEs。通过不同的Tad突变体筛选，研究者发现Tad-Tad*（V106W，D108Q）与dTnpB融合而得的TARGET-ABE-C3.0具有优良的特性，其与已知ABEMINI（Cas12f衍生）有类似的活性窗口A3-A4，但编辑效率远高于ABEMINI。

TnpB具有与Cas12f类似的PAM识别位点TTTR，该PAM识别位点过于局限，极大的限制了TnpB和Cas12f的应用潜力。为拓展TnpB及衍生工具的应用场景，研究者以Cas12f的结构信息为指导，针对TnpB的关键位点开展饱和筛选以拓展PAM识别位点，结果发现S188Q突变体能高效编辑PAM为TGTA的位点；S188Q/K和R191K突变体能高效编辑PAM为TCTG、TGTG和TTTC的位点；S188K在PAM为TTTN的位点均有较高编辑效率。以TnpB不同突变体为基础构建的TaRGET-ABE在各类PAM位点的编辑效率也有明显改善。总体而言，TnpB改造让人类基因组中可被TaRGET-ABE编辑的腺嘌呤位点从0.78%拓展至3.12%，极大的提升了其未来应用潜力。

不过TaRGET-ABE的应用还受限于其活性窗口（A3-A4）。研究发现，TnpB的I159W突变能有效拓宽TaRGET-ABE的活性窗口至A3-A6。研究还指出，脱氨酶突变同样能改变工具的活性窗口，其中Tad-Tad8e（WQ）二聚体与dTnpB融合而得的TaRGET-ABE-C3.1的活性窗口为A2-A4。

与传统ABEs相比，TaRGET-ABE的优势在于体积小，因此适合单一AAV系统递送。为此研究者在细胞水平和动物水平对单一AAV系统递送TaRGET-ABE实现单碱基编辑的效果进行了分析。研究者在多种细胞系中证实，AAV系统递送的TaRGET-ABE能有效实现单一靶位点和多靶位点的精准编辑。其中在ErbB4阳性的H661肿瘤细胞中，研究者利用新工具实现了HER4基因双靶位点的同时编辑，从而有效抑制了肿瘤细胞的生长。随后研究者还通过尾静脉注射检测了AAV9系统递送的TaRGET-ABE-C3.1在小鼠体内各组织的编辑效率，发现其在肝脏中的最高编辑效率可达11%。最后研究者还对小鼠体内TaRGET-ABE在DNA和RNA水平的脱靶效应进行了检测，发现新工具在DNA和RNA水平的脱靶风险较高，这需要未来研究的进一步提升和改进。

总体而言，研究者通过gRNA改造和蛋白优化，首次以TnpB为基础开发出了新型超迷你单碱基编辑器TaRGET-ABE。通过进一步的蛋白突变筛选，TnpB的PAM识别位点及TaRGET-ABE的活性窗口也得到了进一步的拓展和提升。此外，TaRGET-ABE可通过单一AAV系统进行动物体内的有效递送和精准编辑，这为单碱基编辑器的未来应用奠定了基础。

https://doi.org/10.1038/s41589-022-01077-5

制版人：十一

参考文献

1. Karvelis, T. et al. PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage.Nucleic Acids Res. 48, 5016-5023 (2020).

2. Karvelis, T. et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.Nature599, 692–696 (2021).

3. Altae-Tran, H. et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.Science374, 57–65 (2021).

4. Kim, D. Y. et al. Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus.Nat. Biotechnol. 40, 94–102 (2021).

5. Xu, X. et al. Engineered miniature CRISPR–Cas system for mammalian genome regulation and editing.Mol. Cell81, 4333–4345 (2021).

6. Wu, Z. et al. Programmed genome editing by a miniature CRISPR–Cas12f nuclease.Nat. Chem. Biol.17, 1132–1138 (2021).

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