免疫原性细胞死亡（ICD）因通过诱导抗肿瘤免疫反应来提高肿瘤治疗效果而备受关注。ICD的特点在于免疫刺激性损伤相关模式分子（DAMP）的细胞外动员，可刺激树突状细胞（DC）成熟，并通过激活T细胞进一步启动适应性抗肿瘤免疫。并且ICD与内质网（ER）应激密切相关，可以触发未折叠蛋白反应（UPR）和DAMPs的释放。然而，大多数ER靶向光敏剂或光热剂都存在复杂的合成和重金属细胞毒性。因此，开发有机小分子作为具有潜在临床应用的ER 靶向II型ICD诱导剂非常有吸引力。

日前，香港中文大学唐本忠院士、华南理工大学张云娇副教授和高蒙副研究员通过将化学治疗药物苯丁酸氮芥（Cbl）与水杨醛（SA）的简单结合，开发了一种ER靶向荧光自我报告ICD诱导剂SA-Cbl（图1）。SA-Cbl可以选择性地在ER中积累以诱导快速ROS生成和未折叠蛋白反应过程，从而导致损伤相关模式分子的快速释放和树突状细胞成熟。同时，基于SA-Cbl的荧光开启可以原位监测ER 靶向积累和ER应激诱导过程；SA-Cbl对pH和极性高度敏感，可以选择性地与ER蛋白相互作用。并且SA-Cbl优越的抗癌免疫作用通过体内肿瘤模型得到进一步验证。因此，该研究提供了一种通过用pH值和极性敏感的有机荧光团修饰化疗药物来开发荧光自我报告ICD诱导剂的新策略。该工作以“A Self-Reporting Fluorescent Salicylaldehyde–Chlorambucil Conjugate as a Type-II ICD Inducer for Cancer Vaccines”发表在《Advanced Materials》。

图1. SA-Cbl作为II型ICD诱导剂用于癌症治疗的设计原则

SA-Cbl对pH和极性高度敏感

SA-Cbl很容易由5-（溴乙酰基）水杨醛和苯丁酸氮芥通过一步反应制备。制备了化合物SA-A、SA-DPR、MS-Cbl和HA-Cbl作为对照（图2A）。因为SA-Cbl、SA-A和SA-DPR含有一个pH敏感的SA基团，所以首先检查了pH对其光物理性质的影响（图2C-E）。对于化合物SA-Cbl，320/373 nm处的吸收强度和≈480 nm处的发射强度随着pH值的增加而逐渐增加，这可归因于5-乙酰水杨醛中羟基的产生。去质子化SA-Cbl在碱性溶液中的强发射可归因于π-π*跃迁，而非发射性n-π*跃迁在酸性溶液中占主导地位（图2B）。此外，随着DMSO组分数的增加，在DMSO/甲苯混合物中观察到SA-Cbl的红移和发射增加（图2F-G），这也可以归因于极性溶剂中邻近效应（SOPE）抑制n→π*跃迁的能隙增加，π-π*跃迁的能隙降低。因此，仅在极性溶剂（MeOH、EtOH和MeCN）中观察到SA-Cbl的强烈发射（图2H）。随着甘油分数增加，SA-Cbl在PBS/甘油混合物中也显示出显著的发射增强（图2I-J），这可归因于高粘度介质中分子内运动（RIM）的限制。此外，随着分离的ER蛋白浓度的增加，可以观察到SA-Cbl从500到480 nm逐渐增加和蓝移发射（图2K），这表明SA-Cbl可以有效结合内质网蛋白的疏水结构域，并通过RIM开启荧光。以上结果表明，pH和极性敏感的SA-Cbl具有与ER蛋白的有效结合能力，有望用于ER靶向成像。

图2. SA-Cbl对pH和极性高度敏感

SA-Cbl的ER应激诱导

研究者首先研究了SA-Cbl、SA-DPR和SA-A的细胞成像能力，并在1分钟的孵育时间内迅速观察到强烈的细胞内荧光信号。有趣的是，SA-Cbl和SA-DPR 可以选择性地在ER中积累（图3A）。然后研究者评估了这些化合物在B16F10细胞中的ER应激诱导能力。通过与SA-Cbl孵育，观察到DCFH-DA指示的细胞内ROS水平随时间快速增加，而ER-Tracker Red的发射强度显著降低（图3A）。同时，基于Ca2+荧光探针Fluo-3观察到游离Ca2+离子从ER到细胞质的易位时间依赖性增加（图3B）。这些结果表明SA-Cbl可以有效地诱导ER中的氧化应激。进一步研究SA-Cbl的ER应力诱导机制。通过处理SA-Cbl观察到p-PERK和p-elf2α的浓度依赖性上调（图3C），表明SA-Cbl可以有效地诱导ER应激。并且，乳酸脱氢酶（LDH）的泄漏和细胞不可渗透的鬼笔环肽-FITC进入癌细胞进一步表明SA-Cbl可以增加细胞膜通透性（图3D-E）。

图3. SA-Cbl的ER应激诱导表征

SA-Cbl诱导DAMPs表达

然后，研究者研究了SA-Cbl诱导的损伤相关模式分子（DAMP）的表达。通过CLSM图像、定量流式细胞术和蛋白质印迹分析发现SA-Cbl以剂量依赖性方式诱导ecto-CRT的表达和HMGB1和HSP90的细胞外释放（图4A-D）。此外，SA-Cbl组的ATP分泌量比对照组和DOX组高4.5倍和2.2倍（图4E）。

图4. SA-Cbl或DOX诱导B16F10细胞ICD相关DAMPs

SA-Cbl有效地促进DCs成熟

研究者进一步研究了SA-Cbl处理的B16F10细胞对DC的激活发现，用SA-Cbl处理的癌细胞易受BMDCs的吞噬作用（图5A）。流式细胞仪进一步分析了 DCs的活化和成熟发现SA-Cbl 组DCs成熟标志物CD40、CD80、CD86以及主要组织相容性复合物II类（MHC II）显著上调（图5B-C）。SA-Cbl 组中CD40 +MHC II+DCs的比例（50.7%）是 DOX 组（41.9%）的1.2 倍和对照组（20.2%）的2.5 倍，而CD80+的比例，SA-Cbl组（69.3%）的CD86+DCs也远高于DOX 组（62.7%）和对照组（45.5%）。这些结果表明，SA-Cbl处理的癌细胞可以有效地促进DCs成熟。

图5. SA-Cbl有效地促进DCs成熟

SA-Cbl的体内ICD免疫原性评估

为了评估SA-Cbl的体内ICD免疫原性，研究者建立了预防性肿瘤疫苗接种模型（图6A）。与对照组相比，SA-Cbl可以显著抑制肿瘤生长，这也远优于I型ICD诱导剂DOX。并且SA-Cbl处理的癌细胞可以作为癌症疫苗促进体内DCs 成熟（图6B-C），免疫抑制性肿瘤微环境也受到了调节（图6J-K）。综上所述，与经典的I型ICD诱导剂DOX相比，SA-Cbl 在诱导抗肿瘤免疫和免疫记忆效应方面表现出优异的效果。此外，SA-Cbl的生物安全性可以在疫苗注射到体内的过程中得到保证，因为从垂死的癌细胞中泄漏的SA-Cbl会与血清中的蛋白质相互作用并失去细胞毒性。因此，SA-Cbl可以作为一种理想的ICD诱导剂用于癌症疫苗的开发。

图6. SA-Cbl的体内ICD免疫原性评估

小结：研究者利用水杨醛（SA）基团修饰化疗药物苯丁酸氮芥（Cbl）开发了一种化疗II型ICD诱导剂SA-Cbl。具有pH值和极性敏感性的SA-Cbl可用于自我监测ER靶向治疗过程。SA-Cbl还可以有效地诱导ER中的氧化应激和损伤相关分子模式（DAMP）的上表达。并且，SA-Cbl诱导的抗肿瘤免疫和免疫记忆效应通过预防性肿瘤疫苗接种模型和免疫细胞分析在体内得到了很好的证明。该研究为开发基于ER靶向有机小分子作为具有自我报告功能的II型ICD诱导剂的癌症疫苗提供了新策略。

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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202205701

来源：高分子科学前沿

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