本文来源：复旦大学脑科学转化研究院，已获授权转载。

#脑海Yeah 第57期#

刘琢在好莱坞的众多科幻片中，大家总能看到很多有关克隆人的猜想，从最开始的“多莉模式”，到后来只需要取一小块组织碎片便能大规模炮制同一个人，背地里见证的其实是人们对于干细胞理解的进阶。

《生化危机5》剧照

《遗落战境》剧照

不知道大家有否由此想象过一种全新的医疗模式——从自己身上取一块皮肤或者口腔细胞，可能如同咽拭子一样轻轻一刮，就能让它变成一个全新的器官，这样一来那些器官衰竭或者坏死的病人就不用在医院苦苦等待合适的器官移植了，来自自己的肯定也最适合自己，还能避免免疫排斥等诸多不良反应，甚至大脑想以旧换新也指日可待，可谓是一举多得，若是能成真不知道造福多少患者。

这样的场景在今天看来已经不算遥远了，器官的出现与发展，已经为再生医学的研究打开了全新的大门。就神经科学而言，2013年Lancaster在nature上发表的研究成果正式开启了大脑类器官的科研领域，九年过去了，以皮层为首的脑类器官各项研究可谓是层出不穷。人的大脑基本都遵循着一种自然发育模式，在皮层类器官发育方面，目前已经出现各种各样的诱导手段，并且诱导出来的类器官都具备皮层的基本特性，那哪种诱导方式最能模仿人类大脑本身的发育模式呢？以色列特拉维夫大学萨克勒医学院的Yechiel Elkabetz也有着相同的困惑，今天我们就跟随他一起探讨诱导皮层类器官各种方法之间的差异。

1. 类器官的制作，与人类胚胎脑组织的RNA-Seq对比

针对现有诱导皮层类器官的各路方法，作者首先设计了四组诱导路径进行比较： 1) Wnt-i：单独使用Wnt抑制剂XAV-939生成的类器官； 2) Dual-SMAD-i：这一组的抑制剂使用的是TGFβ抑制剂SB-431542和BMP抑制剂NOG的组合，因为二者都与SMAD家族蛋白有着重要联系，故将其称为Dual-SMAD-i； 3) Triple-i：联合上述三种药物生成的类器官，这一组是用来参考最直接的皮层分化模式 4) Inhibition-free：不使用抑制剂生成的类器官；

这三种抑制模式都是在诱导分化的早期进行的，且时间从Day2到Day11，只有短短两个星期不到，相比很多类器官的诱导方法里要在发育过程中长期持续地注入抑制剂，作者选用的模式可谓是迅速而简短。

类器官选用人类胚胎干细胞 (hESCs)进行诱导，取17天和30天的时间点进行RNA测序等分析。并将所有类器官的转录数据集，跟艾伦人脑图谱研究中获得的16个8~37孕周的胎儿大脑数据集进行比较。

图表 1：类器官的RNA序列在第30天便已经出现了明显的变化

结果发现未分化的人多能干细胞、第17天和第30天的器官都形成了单独的集簇，这些独立的细胞簇反映了从多能性到早期及后期发育阶段的转变，其中，第30天的样本已经可以根据不同的抑制类型进一步区分。并且只有Triple-i表现出强烈且同质的皮层特征。 这就表明，早期也就是2-11天所摄入的SMAD抑制剂和WNT抑制剂就足以促进类器官向前脑和皮层的分化走上正常胎儿大脑的轨道上。

2. 抑制模式与皮层放射状结构的生成

接下来作者使用NOTCH通路的效应物——HES5作为Marker显示神经干细胞的活动，（这里涉及到该作者在2017年的一篇报道——分离NOTCH通路高活的Rosette作为识别皮层命运神经干细胞的示踪器，详见参考文献）样本为17天的hESC类器官。

图表 2 各种抑制模式对于神经干细胞中Rosette形成的影响

（绿色箭头表示增强的NOTCH活性区域和放射状结构；白色箭头表示缺乏NOTCH激活的放射状结构；红色箭头所指向的突起强调是非神经上皮细胞的延伸） 这里的数据分析表明inhibition-free和WNT-i条件下衍生的类器官显示出低NOTCH激活信号，而Dual-SMAD-i和Triple-i类器官都产生了NOTCH活性增强的区域，但在Triple-i类器官中，NOTCH的活化区域更多地局限于放射状结构里面。这就说明Triple-i模式更加有利于皮层放射状结构的生成。

3. 从单细胞转录组结果衡量抑制

模式的区别接下来就是对来自4个iPSC系的类器官进行单细胞测序，选用的是第50天的类器官，这样相比于前30天的类器官而言，分化细胞特性的累积会更加明显。

图表 3 对四个iPSC-line与四种抑制模式进行的单细胞测序，也显示出Triple-i在各个line中具有的优势表达

在所有四种iPSC细胞系中，单细胞转录组出现了相当多的重叠部分，表明所有细胞系都有能力产生相似的细胞类型。相比之下Triple-i细胞在不同细胞系中的分布相似，表现出一致且稳定的皮层特征，而Dual-SMAD-i和inhibition-free的细胞在不同的细胞系中分化则不尽相同。

这一方面说明Triple-i这种模式在生成稳健的皮质类器官方面的优越性。另一方面，外界的条件在早期就引发了区域偏差，即使是抑制剂停用近40天以后这种偏差依然存在于神经元干细胞及其后代中。

4. 外侧放射状胶质细胞（oRG）对于类器官发育的评估

放射状胶质细胞不仅是一种神经元前体细胞，也是皮层新生神经元向表层迁移的“支架”，是神经发育中极为重要的一种细胞。作者研究了脑室区以外的区域，发现在所有四个line中，Triple-i类器官有更多的TBR2+ (表达EGFP)的中间祖细胞 (IP)，这些细胞也形成了相当大的脑室下区样的结构。 通过观察脑室区域周围的SOX2+细胞，发现标记放射状胶质细胞 NSCs的SOX2+和HOPX+细胞在Triple-i类器官中出现的比例更高。

图表 4

这些发现与单细胞转录组中的结果形成了呼应，即triple-i类器官中放射状胶质细胞增强的基因表达。这些发现强调了Triple-i方法能够重复生成丰富的皮层命运的NSCs，与不同细胞系里增殖带细胞的多样性相吻合。紧接着是要在三个不同细胞系的类器官发育的后期阶段，观察triple-i类器官中放射状胶质细胞的特征是否依然存在。

图表 5

图示类器官的冷冻切片中单个皮层单元的脑室区、内脑室区和外脑室区。许多皮层单元中除了TBR2+ 中间祖细胞外，还含有SOX2+细胞，但缺乏明确的Rosette，这表明这些单元是通过其外脑室区进行冷冻切片的

图表6

这些密集区域由表达放射状胶质细胞marker的NSCs组成，里面有存在SOX2+细胞，像Rosette里面能见到，中间祖细胞和神经元分布的地方也能见到，但是密集区域以外很少能检测得到。

这表明，这些被我们称为皮层单元的密集核区域，在体外与脑室区和潜在的内外脑室区所具有的对应关系是不一样的。在第80天评估的所有三个细胞系(ZIP13K5、ZIP8K8和H9)中，triple-i衍生的类器官主要就是由这些皮层单元组成。而Dual-SMAD-i模式下，只有一个line的类器官产生皮层单元，其余的就完全缺乏皮层单元。

图表 7

在由triple-i衍生的ZIP8K8类器官中，深层和上层神经元marker CTIP2和SATB2表达水平更高，在皮层单元内外表达更均匀，标记了生发区新生迁移神经元和皮层板样区域积累的神经元。上层神经元标记物CUX1在所有细胞系的皮层单元内外的Triple-i类器官中均有表达. 这就说明Triple-i方法能够使皮层神经元出现很高程度的多样化结语 总之，通过对不同方法在转录谱、细胞结构特征和细胞命运获取方面的系统比较，作者发现了一种早期短时程的方法，即使用Triple-i进行皮层类器官的诱导，该方法大大改善了人类类器官有限的皮层多样性，从而概括了皮层发育的基本特征，并为基于脑类器官的疾病建模提供了重要的基础。

参考文献

Rosebrock D, Arora S, Mutukula N, Volkman R, Gralinska E, Balaskas A, Aragonés Hernández A, Buschow R, Brändl B, Müller FJ, Arndt PF, Vingron M, Elkabetz Y. Enhanced cortical neural stem cell identity through short SMAD and WNT inhibition in human cerebral organoids facilitates emergence of outer radial glial cells. Nat Cell Biol. 2022 Jun;24(6):981-995. doi: 10.1038/s41556-022-00929-5. Epub 2022 Jun 13. PMID: 35697781; PMCID: PMC9203281.（本文）

Edri R, Yaffe Y, Ziller MJ, Mutukula N, Volkman R, David E, Jacob-Hirsch J, Malcov H, Levy C, Rechavi G, Gat-Viks I, Meissner A, Elkabetz Y. Analysing human neural stem cell ontogeny by consecutive isolation of Notch active neural progenitors. Nat Commun. 2015 Mar 23;6:6500.

doi: 10.1038/ncomms7500. PMID: 25799239; PMCID: PMC4383005. Elkabetz Y, Studer L. Human ESC-derived neural rosettes and neural stem cell progression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2008;73:377-87. doi: 10.1101/sqb.2008.73.052. Epub 2009 Feb 9. PMID: 19204067.