血管植入物的内皮化在维持长期血管通畅方面起着至关重要的作用。原位内皮化和再内皮化通常是通过选择性促进内皮细胞（EC）粘附并同时抑制平滑肌细胞（SMC）粘附来实现的。目前，利用细胞外基质衍生的EC选择性肽（主要是REDV和YIGSR），实现了这种EC与SMC的选择性并广泛用于血管相关的生物材料。然而，EC选择性肽的应用由于其容易蛋白水解、合成耗时且价格昂贵而受到限制。

为了解决这些限制，华东理工大学刘润辉教授发现了使用两亲性β-肽聚合物通过调节血清蛋白吸附来设计和寻找EC选择性生物材料的聚合策略（图1）。最佳的β-肽聚合物在EC与SMC的细胞粘附、增殖和迁移方面表现出EC与SMC的选择性甚至优于REDV肽。机制研究表明，牛血清白蛋白的表面吸附在β-肽聚合物的ECs与SMCs选择性中起关键作用。此外，最佳β-肽聚合物的表面修饰可有效促进血管植入物的内皮化并抑制内膜增生。本研究为设计和寻找EC选择性生物材料提供了一种替代策略，在血管相关生物材料的研究和应用中具有巨大的潜力。相关工作 以“A Polymeric Strategy Empowering Vascular Cell Selectivity and Potential Application Superior to Extracellular Matrix Peptides ”发表在《Advanced Materials》。

图1. EC与SMC的选择性策略

EC选择性粘附的最佳β-肽聚合物

为了寻找EC选择性生物材料，通过β-内酰胺的开环聚合制备了三个系列的 β-肽聚合物，分别命名为 NMxCPy、NMxCHy和NMxCOy（图2A）。这些聚合物的聚合度约为40，阳离子和疏水氨基酸残基的比例可变（x=0.4-1，x+y=1）（图 2B）。这些两亲性β-肽聚合物具有可调的电荷密度和疏水性，并且都具有N端巯基，以促进它们共价接枝到马来酰亚胺功能化50孔载玻片表面，以快速评估细胞粘附和增长（图2C）。将细胞接种于各种β-肽聚合物修饰表面2天后，NMx CHy系列β-肽聚合物支持人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与人脐动脉平滑肌细胞（HUASMCs）的更高区域覆盖率比其他两个系列的聚合物（图2D）。其中，聚合度为40的NM40CH60在HUVEC粘附和扩散方面表现出最佳性能，甚至优于REDV，与RGD肽相当（图2E）。研究者进一步评估了具有可变长度（DP = 10、20、40、80和120）的NM 40CH 60 β-肽聚合物的EC和SMC 粘附性。在这些β-肽聚合物中，聚合度为40的NM40CH60在HUVEC与HUASMC 的细胞密度和扩散面积方面表现出最佳的EC选择性性能（图2F）。

图2. EC选择性粘附β-肽聚合物的合成与发现

表面表征和生物相容性

将硫醇封端的最佳β-肽聚合物NM40CH60共价修饰到玻璃表面。AFM表征显示用NM 40CH 60 进行表面改性后表面粗糙度显著增加（图3A）。WCA测量表明，将OEG8和NM40CH60依次接枝到胺功能化玻璃表面导致表面接触角从58° 降低到44°，然后增加到57°（图3B）。XPS分析表明，随后C/O和C/N比率的变化证实了OEG8和NM 40CH 60 的进一步修改（图3C-D）。研究者研究NM40CH60支持HUVEC粘附的能力发现，HUVECs在NM40CH60表面的扩散面积与RGD表面没有显著差异（图3E）。此外，NM40CH60和RGD表面上的HUVEC具有有序的肌动蛋白丝，与REDV表面上的HUVEC不同（图3F）。研究者进一步检查了最佳β-肽聚合物NM 40CH 60 的血液相容性（图3G）发现血小板完全铺展，这意味着高度活化状态。

图3. 最佳β-肽聚合物修饰表面的表征、功能和血液相容性

体外细胞选择性生长行为

为了评估NM40CH60的EC与SMC选择性，研究者表征了HUVECs和 HUASMCs在NM40CH60改性表面上的生长和迁移行为。对细胞接种后72 h的表面细胞覆盖率和细胞密度的评估表明，NM40CH60促进了HUVEC的快速生长，与RGD肽的性能相当，优于REDV肽的性能（图4A-C）。其中，NM40CH60强烈抑制HUASMCs的生长，类似于EC选择性REDV肽的表现（图 4D-F）。为了进一步探索快速内皮化的能力，HUVECs和HUASMCs在NM40CH60表面上的迁移通过评估测量原位细胞迁移的轨迹 (图5A)。结果表明，NM 40CH 60 在细胞迁移速度和距离上均促进HUVECs并抑制HUASMCs，与REDV肽的性能相当（图 5B）。

图4. NM40CH60修饰的表面使EC选择性细胞生长

研究者继续研究HUVEC和HUASMC在NM40CH60表面上的竞争性生长行为。NM40CH60和REDV均选择性促进HUVECs相对于HUASMCs的粘附和扩散；而如预期的那样，在RGD表面上没有观察到细胞选择性（图5C-D）。培养 12 h后，NM40CH60保持了优异的EC与SMC选择性和EC的铺展形态（图5E）。这些结果表明，NM 40CH 60 在支持内皮化和EC对SMC选择性方面优于广泛使用的REDV肽。

图5. NM40CH60修饰促进了细胞迁移中的EC选择性和共培养中的竞争性粘附

EC选择性粘附机理分析

为了弄清楚NM40CH60的EC与SMC选择性的机制，研究者分别比较了 HUVECs和HUASMCs在无血清和含血清培养基中的粘附。在NM40CH60表面，血清蛋白对HUVECs和HUASMCs的细胞粘附和扩散具有深远的影响。血清蛋白的存在显著增强了HUVEC的细胞粘附和扩散，并显著抑制了HUVSMC的细胞粘附和扩散（图6A-D）。研究者进一步评估了NM40CH60、REDV和RGD表面对血清全蛋白和单个蛋白质的蛋白质吸附。NM40CH60显著促进血清全蛋白（图 6E）和重要的粘附血清蛋白的吸附，以及抗-粘附蛋白牛血清白蛋白（BSA）（图 6F-G）。这些结果表明，NM40CH60对SMC的优越选择性可能与表面吸附的血清蛋白有关。

图6. 血清蛋白对EC和SMC在NM40CH60修饰表面粘附的影响

研究者进一步通过研究发现在无血清培养基中添加BSA对HUVEC的粘附和扩散没有明显影响，但显著抑制了HUASMCs的粘附和扩散（图7A-B）。仅将BSA添加到无血清培养基中也发现了明显的EC选择性（图7C）。这些结果表明BSA在NM40CH60的EC选择性中的关键作用。此外，与REDV和RGD表面相比，NM40CH60表面吸附的BSA以更高的密度均匀分布，这可能会阻碍其他血清蛋白的粘附位点，从而根据细胞类型减少细胞粘附（图7D）。研究者进一步通过蛋白组学分析发现，BSA的存在减少细胞粘附对EC的影响比SMC弱，并解释了NM40CH60的EC与SMC选择性（图7F-G）。

图7. BSA和细胞膜蛋白对EC选择性粘附在NM40CH60修饰表面的影响

EC选择性β-肽聚合物在心血管支架中的应用

细胞粘附结果表明，NM40CH60修饰的316L SS不仅显著促进了HUVEC粘附，而且还显著抑制了HUASMC粘附，这使得NM40CH60修饰的316L SS具有更好的EC选择性（图8A）。然而，与316L SS和REDV修饰的表面相比，NM40CH60表面的总NO释放量更高，这表明NM40CH60表面可以促进EC粘附，具有更高的细胞密度并维持EC的健康功能（图8B）。此外，NM40CH60修饰的316L SS不仅显著促进HUVEC迁移，而且还显著抑制了HUASMC迁移（图8C-D）。

图8. EC和SMC在NM40CH60修饰的316L SS上的粘附、NO释放和迁移行为

EC选择性β-肽聚合物修饰心血管支架的体内评价

植入4周后，通过H&E染色分析样品上的新内膜区域（图9A-B）。与裸露的316L SS线相比，NM40CH60功能化的316L SS线的横截面积减少了54%的新生内膜组织面积（图9C）。新内膜组织的免疫荧光染色用于分析内皮化和内膜增生的程度（9D）。通过进一步的分析表明，NM40CH60对316L SS表面的功能化可以有效减少合成表型SMCs引起的体内增生，促进再内皮化（图9E-H）。

图9. NM40CH60修饰的316L SS植入物的体内评价

小结：本研究展示了一种有效的替代策略来设计和寻找EC选择性生物材料。最佳的β-肽聚合物NM40CH60显示出显著的EC与SMC选择性，甚至优于EC选择性REDV肽。由于β-肽聚合物对蛋白水解的高稳定性、易于和可扩展的合成以及廉价的优势，本研究为设计和寻找在血管相关组织工程应用中具有巨大潜力的EC选择性生物材料提供了一种有前途的聚合物策略。

原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202200464

来源：高分子科学前沿

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