单体药理-Q1区-上交大新华医院&海军军医大揭示人参皂甙Rc调节肠道菌群和粪便代谢物改善动脉粥样硬化

编译：微科盟coco，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

动脉粥样硬化（AS）和伴随而来的心血管疾病（CVDs）是全球主要的死亡原因。最近，心血管疾病、肠道微生物群和代谢物之间的关联引起了越来越多的关注。在这项研究中，我们在高脂饮食 (HFD) 的载脂蛋白 E 缺乏(ApoE-/-) 小鼠中研究了人参皂苷 Rc (GRc) 的潜在机制，这是一种用于治疗 CVD 的人参皂苷的活性成分。7周龄雄性ApoE-/-小鼠被随机分为四组：正常对照组（NC）组、HFD组、GRc组（40 mg/kg/d）和阿托伐他汀（Ato）组（10毫克/公斤/天）。我们通过主动脉病变、血脂水平和炎症因子评估动脉粥样硬化损伤，分别使用 16S rRNA 序列和非靶向代谢组学分析肠道微生物群的组成和粪便代谢物谱。结果表明，GRc显著减轻了HFD引起的主动脉病变，降低血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素 (IL)-6 以及IL-1β，而高密度脂蛋白胆固醇 (HFD-C) 水平升高，肠道微生物群组成、功能和代谢物谱也发生改变。 GRc 还逆转了门水平的拟杆菌门和厚壁菌门，而Muribaculaceae、乳酸杆菌、回肠杆菌、双歧杆菌、Faecalibaculum、颤杆菌、经黏液真杆菌和Eubacterium_coprostanoligenes_group在属水平的 HFD 变化，以及涉及牛磺酸和次牛磺酸代谢的23种关键代谢产物、精氨酸生物合成、ATP结合盒 (ABC) 转运蛋白、初级胆汁酸生物合成、嘌呤代谢、三羧酸 (TCA) 循环和胰高血糖素信号通路也发生了改变。此外，8 个属水平的肠道差异菌群与 23 种涉及动脉粥样硬化损伤的关键差异代谢物相关。总之，我们的研究结果表明，GRc 改善了动脉粥样硬化损伤，调节了 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠的微生物和代谢组学变化，并表明胃肠道微生物群、代谢产物和动脉粥样硬化损伤之间可能存在关于 GRc 抗 AS机制的相关性。

论文ID

原名：Ginsenoside Rc ameliorated atherosclerosis via regulating gut microbiota and fecal metabolites

译名：人参皂苷 Rc通过调节肠道微生物和粪便代谢物改善动脉粥样硬化

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF：5.988

发表时间：2022.09

通讯作者：刘国平，柳润辉

通讯作者单位：上海交通大学附属新华医院 & 海军军医大学

实验设计

实验结果

1. 人参皂甙 Rc 减少高脂饮食诱导的 ApoE-/- 小鼠的动脉粥样硬化病变

在这项研究中，我们首次使用 16S rRNA 序列和非靶向粪便代谢组学方法研究了 GRc 在 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中对抗 AS 的作用和潜在机制（图 1）。GRc 的化学结构如图 2A 所示。在动物实验期间，我们监测小鼠体重以研究GRc对生理特性的影响。如补充图 S1 所示，在治疗期间，NC、HFD、Ato 和 GRc 组的体重增加没有显著差异，这意味着研究中 GRc 的剂量对于 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠是安全的。

图1 在 ApoE-/- 小鼠中检查 GRc 对 AS的抗动脉粥样硬化作用和潜在机制的工作流程。研究对不同的肠道微生物群、粪便代谢物和 AS 指数进行了联合分析。

图2 GRc 减轻了 HFD 诱导的ApoE-/- 小鼠（n = 6）的动脉粥样硬化病变。(A) GRc 的化学结构。(B) 使用显微镜拍摄的主动脉弓照片。(C) 油红O染色对整个主动脉的代表性照片，并对整个主动脉的斑块面积进行了定量。(D) H&E染色和Masson染色的主动脉窦切片的代表性图像；bar= 400 微米。我们定量了主动脉窦中的病变和胶原面积。数据表示为平均值±SEM。*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 vs. NC；#p < 0.05、##p < 0.01 和 ###p < 0.001 与HFD。NC，正常控制；HFD，高脂肪饮食；Ato，阿托伐他汀；GRc，人参皂甙 Rc。

HFD诱导的 ApoE-/- 小鼠已被广泛用于构建AS的动物模型。 GRc 对AS的影响取决于 HFD 诱导的ApoE-/-小鼠整个主动脉中斑块病变的大小。HFD组主动脉粥样硬化斑块面积较NC组明显增加。与 HFD 组相比，GRc或 Ato 显著减少了 HFD 诱导的ApoE-/- 小鼠的主动脉斑块面积（图 2B，C）。然后，我们使用H&E和Masson三色染色测量和量化主动脉窦中的动脉粥样硬化病变和胶原蛋白含量，发现HFD组动脉粥样硬化病变的大小和主动脉窦内的胶原蛋白含量远大于NC组。与 HFD 组相比，GRc或 Ato 治疗明显减少了动脉粥样硬化病变区域的大小和主动脉窦中的胶原含量（图 2D），表明 GRc 治疗在减少HFD 引起的动脉粥样硬化损伤方面与 Ato 相似。

2.人参皂甙 Rc 改善了喂食高脂饮食的 ApoE-/- 小鼠的血脂水平和全身炎症

鉴于脂质水平和全身炎症细胞因子在 AS 的进展中起重要作用，我们进一步确定了血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C、TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的水平。与NC组相比，HFD组血清TC、TG、LDL-C显着升高，而血清HDL-C显著降低。用 GRc 或 Ato 治疗显著降低了 TC、TG 和 LDL-C 水平并增加了 HDL-C 水平（图 3A-D）。如图 3E-G 所示，喂食 HFD 的 ApoE-/- 小鼠的血清 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 比 NC 组高得多，而GRc和Ato组均显著降低炎症细胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β。这些结果表明，GRc 改善了 HFD 喂养的 ApoE-/- 小鼠的脂质水平和全身炎症。

图3 GRc 调节 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中的脂质和全身炎症细胞因子。（A-D）每组的血清脂质（TC、TG、LDL-C 和 HDL-C）水平。（E-G）每组炎性细胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）的水平。数据表示为平均值±SEM。*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 vs. NC；#p < 0.05、##p < 0.01 和 ###p < 0.001 与 HFD。NC，正常控制；HFD，高脂肪饮食；Ato，阿托伐他汀；GRc，人参皂甙 Rc。

3.人参皂甙Rc对 ApoE-/- 小鼠肠道菌群组成的影响

对 16S rRNA 进行测序以确定 GRc 处理对肠道微生物群组成的影响。总体而言，我们从 24 个盲肠样本（每个样本 72,557.42 ± 281.66 个干净读数）中总共获得了 1,741,378 个干净读数，并观察到1,506,396 个有效标签，平均长度范围为 415.83 至 419.56。经过数据处理，我们总共获得了 9802 个 OTU（每个样本 2414.13 ±75.93 个 OTU）。为了进一步观察群落的丰富度和多样性，我们通过 Chao1 指数获取肠道微生物丰富度，通过香农指数获取肠道微生物多样性。每个样本内的曲线在香农稀疏图（补充图 S2）中都是平坦的，这意味着测序范围能够确定细菌群落的生物多样性。如图 4A、B 所示，HFD 组的 Chao1 和香农指数与 NC 组相比显著降低，表明 ApoE-/- 小鼠摄入 HFD 后肠道微生物丰富度和多样性显著降低。基于未加权 unifrac 指标的 PCoA 用于证明细菌群落组成的差异。同一组中的 PCoA 斑点聚集良好，这意味着同一组样品中细菌群落的组成相似。 NC、HFD 和 GRc 组中 PCoA 斑点的距离明显分开，这表明组间细菌群落的结构不同。与 GRc 相关的差异由 PC1 表示，它解释了微生物组成总变化的 26.25%。与 HFD 相关的差异由 PC2 表示，它解释了总变异的 18.38%（图 4C）。 PCoA 结果表明，GRc 处理对肠道微生物群结构的贡献大于单独喂食 HFD。

图4 GRc对HFD诱导的ApoE-/-小鼠(n = 6)肠道微生物群组成的影响。(A-B)肠道微生物组的丰富度和多样性分别通过Chao1和香农指数进行评估。(C)基于未加权Unifrac指标的PCoA分析，用于OUT级别的所有样本。(D)厚壁菌门和拟杆菌门的结构和相对丰度以及厚壁菌门/拟杆菌门的比例。(E) Muribaculaceae、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Faecalibaculum、颤杆菌、经黏液真杆菌、回肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌在属水平上的结构和相对丰度。数据表示为平均值±SEM。*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 vs. NC；#p < 0.05, ##p < 0.01,和###p < 0.001 vs. HFD; ns，不显着；NC，正常控制；HFD，高脂肪饮食；Ato，阿托伐他汀；GRc，人参皂甙Rc。

如补充图S3所示，各组间肠道微生物群在不同分类水平上发生显著变化。我们列出了与心血管疾病相关的不同肠道菌群。在门水平上，小鼠前六大微生物区系是拟杆菌门、厚壁菌门、脱硫杆菌门、变形杆菌门、弯曲杆菌门和放线杆菌门，其组成在NC、HFD和GRc组之间存在明显差异。HFD组的拟杆菌丰度远低于NC组，而GRc或Ato处理逆转了这种变化。与NC组相比，HFD组的厚壁菌门丰度显著增加，而 GRc 或 Ato 组则显著降低。上述结果导致HFD组中厚壁菌门与拟杆菌门的比率高于NC组，GRc或Ato组的比率低于 HFD 组（图 4D）。在属水平上，在HFD喂养后，粪杆菌、颤杆菌、经黏液真杆菌和Eubacterium_coprostanoligenes_group的相对丰度要高得多，而Muribaculaceae、回肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的相对丰度显著降低。 GRc 治疗在一定程度上恢复了肠道菌群的失衡，这在微生物群组成的属水平上逆转了 HFD 的影响。 Ato 组对回肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌没有显著影响（图 4E）。总体而言，GRc 治疗可以调节不同分类水平的特定肠道菌群。

此外，LEfSe 分析用于突出从门到属的核心细菌表型，这些表型有助于微生物群组成的变化。如图 5A、B 所示，NC 组富含拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目和毛螺菌科目、Muribaculaceae（从科到属）、理研菌科和毛螺菌科以及另枝菌属、Rikenellaceae_RC9_gut_group和 Lachnospiraceae_NK4A136_group ，而HFD组富含厚壁菌门和变形菌门、梭菌、芽孢杆菌和γ‐变形菌类，颤螺菌属、丹毒丝菌目和肠杆菌目、Tannerellaceae、拟杆菌科、Eubacterium_coprostanoligenes_group（从科到属）、梭螺菌科、丹毒梭菌科和肠杆菌科，以及拟杆菌属、大肠杆菌属、丹毒梭菌属和大肠杆菌-志贺氏杆菌属。上述结果表明，HFD 喂养减少了 NC 组中富集的肠道微生物群。 GRc组富集的肠道菌群为伯克氏菌目、普氏菌科、丹毒丝菌科和萨特氏菌科，以及拟普雷沃菌属属、Lachnoclostridium、Allobaculum和Parasutterella，而Ato组的肠道菌群富集程度最低。

图5 HFD诱导的ApoE-/-小鼠(n = 6)的核心细菌表型分析。(A)在不同分类水平上丰富的分类群的LDA分数(LDA显着阈值= 4)。(B) LEfSe分析生成的分类分支图，显示分类群分别在NC组（紫色）、HFD组（蓝色）、GRc组（绿色）和Ato组（红色）中显著富集。每个环代表从门到属的分类水平。环上每个点的直径代表该分类单元的相对丰度。NC，正常控制；HFD，高脂肪饮食；Ato，阿托伐他汀；GRc，人参皂甙Rc。

4. PICRUSt2对微生物群落的预测功能分析

PICRUSt2 预测了 KEGG 通路2级微生物群落的功能分析。当喂食 HFD 时，小鼠的微生物组具有更多的功能基因，用于心血管疾病、其他次级代谢物的生物合成、细胞生长和死亡、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、内分泌系统、消化系统、能量代谢、癌症、细胞过程和信号（图6A）。与 HFD 组相比，GRc 组包含的 CVD 功能基因减少，这意味着 GRc 组中的微生物群落可能对 CVD 具有保护作用（图 6B）。在 Ato 治疗后，小鼠的微生物组在免疫系统疾病、神经系统、碳水化合物代谢、酶家族、内分泌系统、脂质代谢、细胞过程和信号传导、转录和膜转运等方面的功能基因明显减少，而 CVD 的微生物组基因趋于增加（图6C）。

图6 PICRUSt2 (n = 6)对微生物群落的预测功能分析。(A) HFD组和NC组肠道微生物组功能谱的差异。(B) GRc和HFD组之间肠道微生物组功能谱的差异。(C) Ato组和HFD组之间肠道微生物组功能谱的差异。NC，正常控制；HFD，高脂肪饮食；Ato，阿托伐他汀；GRc，人参皂甙Rc。

5. 人参皂甙 Rc 调节 ApoE-/- 小鼠的粪便代谢物

PLS-DA 和 OPLS-DA 模型用于确认各组粪便代谢物的差异。我们应用七折交叉验证和 200 响应排列测试来防止过度拟合，结果显示模型质量良好（补充图 S4）。 PLS-DA 图显示了 NC、HFD 和 GRc 组之间的良好分离，而 Ato 和 HFD 组之间没有明显的分离（图 7A、B）。此外，HFD 和 NC 组之间的 OPLS-DA 图也表现出明显的差异（图 7C），这意味着 HFD 和 NC 组之间的粪便代谢物存在显著差异。然后，我们以 VIP > 1 和 p < 0.05的标准选择 HFD 组和 NC 组之间的差异代谢物。与 NC 组相比，HFD 组有 510 种代谢物上调，605 种下调（图 7D）。GRc 和 HFD 组之间的 OPLS-DA 图显示出明显的分离 (图 7E)。在 GRc 组中，307 种代谢物显著上调，339 种代谢物在 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中下调（图 7F）。这些结果暗示GRc可以调节喂食HFD的ApoE-/-小鼠的粪便代谢谱。

图7 GRc调节ApoE-/-小鼠(n = 6)的粪便代谢物。(A)每组二维PLS-DA得分图。(B)每组的三维PLS-DA得分图。(C) NC和HFD组中的OPLS-DA评分图。(D) NC和HFD组中的相对火山图。(E) GRc和HFD组中的OPLS-DA评分图。(F) GRc和HFD组中的相对火山图。NC，正常控制；HFD，高脂肪饮食；Ato，阿托伐他汀；GRc，人参皂甙Rc。

6.人参皂甙 Rc 调节与动脉粥样硬化相关的代谢途径

为了清楚地显示粪便特征的差异，HFD/NC 和 GRc/HFD 之间的前 50 个差异代谢物被聚集在一起，如图 8A、B 所示。然后，我们对基于整个差异表达的代谢物进行KEGG通路富集分析。值得注意的是，NC 组和 HFD 组之间的显着差异代谢物富集在 53 个重要途径中（p < 0.05）（图 8C），HFD 和 GRc 组之间的差异代谢物富集在 28 个重要途径中（p < 0.05）（图 8D ）。 NC/HFD和HFD/GRc之间有23条重叠通路，包括嘌呤代谢、三羧酸（TCA）循环、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸生物合成、胰高血糖素信号通路、ATP结合盒（ABC）转运蛋白和与 AS 相关的初级胆汁酸生物合成，这些途径可能是潜在的发病机制和治疗靶点（表1），并研究了上述七种途径的差异代谢物。在嘌呤代谢途径中，HFD组腺嘌呤和尿酸明显升高，GRc组明显降低，并且在TCA循环中苹果酸、富马酸、氧代戊二酸、柠檬酸的水平和胰高血糖素信号通路呈现相同趋势。在牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径中，HFD组的牛磺酸和L-谷氨酸低于NC组，GRc处理后这些代谢物明显增加；在精氨酸生物合成途径中的瓜氨酸、鸟氨酸、L-谷氨酸和 L-谷氨酰胺以及 ABC 转运蛋白途径中的山梨糖醇、阿洛糖、赖氨酸和羟脯氨酸中我们检测到相同的趋势。在初级胆汁酸生物合成途径中，胆固醇和甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）较高，而胆酸（CA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、甘氨酸、异石胆酸（isoLCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）和牛磺胆酸的含量较高，HFD组的酸（TCA）低于NC组。这些代谢物在 GRc 组中显著逆转（补充表 S1，S2）。

图8 GRc调节ApoE-/-小鼠(n = 6)的代谢途径。(A) HFD和NC组之间粪便中差异代谢物的聚类热图。(B) GRc和HFD组之间粪便中差异代谢物的聚类热图。(C) HFD和NC组之间的KEGG通路富集散点图。(D) GRc和HFD组之间的KEGG通路富集散点图。丰富因子表示位于KEGG中的差异表达代谢物的数量/位于KEGG中的代谢物总数（NC，正常对照；HFD，高脂饮食；GRc，人参皂甙Rc）。

表1 AS模型中GRc调控的潜在代谢途径

9.肠道代谢与动脉粥样硬化的相关性

为了进一步了解代谢差异，我们对嘌呤代谢、TCA 循环、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸生物合成、胰高血糖素信号通路、ABC 转运蛋白和初级胆汁酸生物合成途径中潜在生物标志物的热图进行了聚类。如图 9A 所示，粪便中的潜在生物标志物很好地聚集在不同的组中。与HFD组相比，GRc组差异表达的粪便代谢物普遍更接近NC组，表明肠道代谢与GRc组比NC组更相似。我们检查了 Spearman 相关性，以了解肠道微生物群、粪便中的潜在生物标志物和动脉粥样硬化指数之间可能存在的联系。

图9肠道代谢与动脉粥样硬化之间的相关性。(A)粪便中潜在生物标志物的聚类热图。(B)肠道微生物群、差异表达的粪便代谢物和动脉粥样硬化参数之间的Spearman相关性分析。红色代表正相关，蓝色代表负相关。*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001（NC，正常对照；HFD，高脂饮食；GRc，人参皂甙Rc）。

我们首先研究了肠道微生物群和粪便潜在生物标志物之间的关系。经黏液真杆菌与腺嘌呤呈正相关，与瓜氨酸呈负相关。 Eubacterium_coprostanoligenes_group与富马酸、苹果酸、柠檬酸、氧代戊二酸、腺嘌呤、尿酸和胆固醇呈正相关，与L-谷氨酸、瓜氨酸、甘氨酸和CDCA呈负相关。 Faecalibaculum与苹果酸、柠檬酸、腺嘌呤、尿酸和胆固醇呈正相关，而与L-谷氨酸和CDCA呈负相关。颤杆菌与富马酸、苹果酸、柠檬酸、氧代戊二酸、腺嘌呤和尿酸呈正相关，与牛磺酸、L-谷氨酸、瓜氨酸和isoLCA呈负相关。然后，双歧杆菌与 L-谷氨酸、鸟氨酸、isoLCA 和甘氨酸呈正相关，而与富马酸、苹果酸、氧代戊二酸、腺嘌呤、尿酸和胆固醇呈负相关。乳酸杆菌与L-谷氨酸、山梨糖醇、阿洛糖、赖氨酸、羟脯氨酸和isoLCA呈正相关，与富马酸、苹果酸、柠檬酸、腺嘌呤和尿酸呈负相关。 Muribaculaceae与L-谷氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、山梨糖醇、赖氨酸、羟脯氨酸和甘氨酸呈正相关，与富马酸、苹果酸、氧代戊二酸、腺嘌呤和尿酸呈负相关。最后，回肠杆菌与 L-谷氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、L-谷氨酰胺、山梨糖醇、赖氨酸、羟脯氨酸和甘氨酸呈正相关，而与富马酸、苹果酸和氧代戊二酸呈负相关。最重要的是，经黏液真杆菌、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Faecalibaculum和颤杆菌似乎与胰高血糖素信号通路、TCA 循环通路（富马酸、苹果酸、柠檬酸和氧代戊二酸）中的代谢物和嘌呤代谢（腺嘌呤和尿酸）呈正相关；和与牛磺酸和亚牛磺酸代谢（牛磺酸和 L-谷氨酸）、精氨酸生物合成（瓜氨酸、鸟氨酸和 L-谷氨酰胺）、ABC 转运途径（山梨糖醇、阿洛糖、赖氨酸和羟脯氨酸）和初级胆汁酸生物合成（CDCA、isoLCA 和甘氨酸）中的代谢物呈负相关，而双歧杆菌、乳酸杆菌、Muribaculaceae和回肠杆菌则表现出相反的变化。

关于粪便电位生物标志物与动脉粥样硬化指标的关系，胰高血糖素信号通路和 TCA 循环途径中的代谢物（富马酸、苹果酸、柠檬酸和氧代戊二酸）几乎与动脉粥样硬化指标呈正相关，但 HDL-C 水平除外，而嘌呤代谢途径中的尿酸和腺嘌呤与表面病变面积和血清TG、IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈正相关。牛磺酸和亚牛磺酸代谢（L-谷氨酸）和精氨酸生物合成（瓜氨酸和鸟氨酸）中的代谢物与除 HDL-C 水平外的动脉粥样硬化参数呈负相关，而 ABC 转运蛋白（山梨糖醇、阿洛糖、赖氨酸和羟脯氨酸）中的代谢物与动脉粥样硬化参数呈负相关（除血清 HDL-C、IL-6 和 IL-1β 水平外）。此外，初级胆汁酸生物合成（CA、CDCA、TCA、TCDCA、GCDCA、isoLCA 和甘氨酸）途径中的粪便潜在生物标志物主要与炎症因子呈负相关（图 9B）。这些结果表明，嘌呤代谢、TCA循环和胰高血糖素信号通路中的代谢物与动脉粥样硬化损伤呈正相关，而牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸生物合成、ABC转运蛋白和初级胆汁酸生物合成途径中的代谢物与动脉粥样硬化损伤呈负相关。一般来说，肠道微生物群、差异表达的粪便代谢物和 AS 之间存在密切联系。

在本研究中，我们探究了 GRc 在 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中对 AS 的影响和潜在机制。我们观察 GRc 治疗后血清脂质和炎性细胞因子、肠道菌群组成结构、粪便代谢物和 KEGG 富集途径的变化；此外，确定了肠道代谢与 AS 之间的相关性。我们发现 GRc 显著减轻了 ApoE-/- 小鼠的动脉粥样硬化斑块。同时，GRc治疗不仅改善了血脂紊乱和系统性炎症，还增加了肠道菌群的多样性和丰富度。此外，GRc治疗调节了特定的肠道菌群、粪便代谢物以及与心血管疾病相关的相关代谢途径。此外，组间粪便代谢物差异也与肠道微生物群差异和动脉粥样硬化损伤密切相关。

血浆 LDL-C 浓度升高是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要危险因素。降低血脂使 AS 的发生和发展成为可能。相比之下，血浆 HDL-C 浓度对炎症、氧化、血管生成和葡萄糖稳态发挥保护作用，并对 AS 产生有利影响。目前的研究表明，在 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中，GRc 治疗显著降低了 TC、TG 和 LDL-C 的血浆水平，并增加了 HDL-C 水平，其经常被用作 AS 的主要动物模型。除了脂质紊乱，有证据表明，AS 是一种慢性炎症性疾病，其特征是血清或动脉粥样硬化斑块中的 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等炎性细胞因子升高。我们的结果表明，GRc 治疗后血清 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平显著降低。此外，GRc组的主动脉粥样硬化斑块、动脉粥样硬化病变和主动脉窦中的胶原蛋白含量显著改善。我们在 Ato 组中也发现了类似的结果，表明 GRc 和 Ato 均具有抗动脉粥样硬化作用。

近年来，由于肠道及其伴随的微生物群落在宿主生理和病理事件中的重要作用，引起了人们的极大关注。越来越多的研究表明，肠道微生物群的变化与包括心血管疾病在内的多种疾病状态相关。据报道，肠道微生物种类的多样性和丰富度降低会增加患 AS 的风险。我们的研究与之前的结果一致，即 HFD 降低了肠道微生物群的多样性，而 GRc 治疗显著增加了 ApoE-/- 小鼠中微生物物种的多样性和丰富度。与之前的研究一致，Ato 处理对微生物物种的多样性和丰富度没有明显影响。此外，不同分类水平的不同特定微生物物种中细菌群落组成的改变也与心血管疾病密切相关。厚壁菌门和拟杆菌门是人体肠道微生物群组成中的两个主要门。据报道，厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加与 CVD 呈正相关。厚壁菌门会恶化代谢内毒素和炎症，增加肥胖和 AS 的风险，而拟杆菌门则有相反的影响。我们结果中的 PCoA 分析表明，NC、HFD 和 GRc 组的肠道微生物群组成具有更大的意义，其中在门和属水平上肠道微生物群的相对丰度也显示出显著差异。 GRc 处理显著增加了拟杆菌门的丰度并降低了厚壁菌门的丰度，然后导致厚壁菌门与拟杆菌门的比率降低，这在 HFD 组中更高。根据之前的研究，Ato 治疗显著增加了 HFD 诱导的小鼠中拟杆菌门的丰度并减少了厚壁菌门。新出现的证据表明，脱铁杆菌和Eubacterium_coprostanoligenes_group与三甲胺/三甲胺 N-氧化物的产生相关，这被认为是 AS 发展为 CVD 的风险标志物，而毛螺菌科与较低的三甲胺 N-氧化物水平和抗血栓形成表型有关。另一方面，高水平的Eubacterium_coprostanoligenes_group与肥胖有关，而肥胖是 AS 的危险因素。此外，有大量的研究报道乳酸杆菌和双歧杆菌对人类健康有益。乳酸杆菌通过调节 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠的反向胆固醇转运来调节氧化应激、炎症过程、以及脂质代谢，虽然双歧杆菌有降低人内脏脂肪量的作用，但随后改善了 AS 的进展，并且对 HFD 引起的肥胖的缓解，伴随着 Muribaculaceae 水平的增加。16S rRNA 分析表明，HFD 组的去铁杆菌科和Eubacterium_coprostanoligenes_group显著增加，而Muribaculaceae、毛螺菌科、双歧杆菌科和乳杆菌科显著减少。GRc处理逆转了HFD诱导的家族水平对肠道微生物群的影响，而Ato处理仅逆转了HFD诱导的Muribaculaceae和Eubacterium_coprostanoligenes_group的水平。在属水平上，研究表明，颤杆菌丰度升高与肥胖小鼠的肠道通透性和炎症密切相关，而回肠杆菌属保护小鼠免于肥胖。我们的研究表明，GRc增加了乳酸杆菌、双歧杆菌、回肠杆菌和 Muribaculaceae 的相对丰度，降低了颤杆菌、Eubacterium_coprostanoligenes_group、经黏液真杆菌和Faecalibacterium 的相对丰度，而 Ato 处理与 GRc 具有相似的效果，但没有显著逆转乳酸杆菌的水平、双歧杆菌和回肠杆菌由 HFD 诱导。我们研究中经黏液真杆菌和 Faecalibacterium的结果与之前的研究不一致，之前的研究表明经黏液真杆菌在 HFD 诱导的小鼠中减少，并且Faecalibacterium 表现出心脏保护作用，而在我们的研究中，GRc 治疗减少了其他肠道菌群，比如拟杆菌属和副杆菌属，这可能会影响 AS 进展，值得进一步研究。除了肠道菌群的组成外，微生物群落的整体功能也越来越受到关注。 PICRUSt2 对微生物群落的预测功能分析表明，GRc 显著降低了 CVD 的功能基因，而 Ato 倾向于增强 CVD 的功能基因。此外，GRc 可能通过调节与 AS 相关的肠道微生物群来表现出抗动脉粥样硬化的作用。

代谢组学已被常规用作发现生物标志物、代谢物的系统水平效应和生物途径微改变的工具，可能有助于人们深入了解各种疾病的潜在机制。我们研究中的 PLS-DA 和 OPLS-DA 分析显示 NC/HFD 和 GRc/HFD 之间的粪便代谢表型存在显著差异。然后，我们在 KEGG 通路中对组间的粪便差异代谢物进行聚类和注释。越来越多的证据表明，肠道微生物群的代谢物与心血管疾病之间存在密切联系。尿酸和腺嘌呤是人体嘌呤代谢的终产物。研究已显示尿酸升高与心血管疾病之间存在密切联系，尿酸升高对心血管健康的有害影响的机制包括氧化应激增加、一氧化氮可用性降低和内皮功能障碍、促进局部和全身炎症、血管收缩和增殖血管平滑肌细胞、胰岛素抵抗和代谢失调。我们的研究结果表明，HFD 诱导了高水平的尿酸和腺嘌呤，而 GRc 显著降低了嘌呤代谢途径中的尿酸和腺嘌呤。最近的研究表明，TCA 循环中的线粒体代谢物不仅被认为是产生能量的中间底物，而且还充当调节基因转录和翻译的关键信号分子。琥珀酸盐已成为几种代谢和 CVD 的循环生物标志物。另一方面，升高的苹果酸和柠檬酸与更高的 CVD 风险相关，富马酸积累激活 TNF-α 和 IL6 细胞因子的基因转录，并通过与谷胱甘肽结合增加 ROS 信号传导。在我们的研究中，我们发现 HFD 显著增加了 TCA 循环或胰高血糖素信号通路中的代谢物，如苹果酸、富马酸、氧代戊二酸和柠檬酸；而GRc 显著降低了上述代谢物。最近，研究者观察到氨基酸代谢的改变与 AS 的发展之间存在密切的关系，其中 L-精氨酸及其代谢改善了 NO 依赖性血管扩张功能，并减少了动脉粥样硬化斑块，逆转内皮功能障碍。在我们的研究中，GRc 对 L-精氨酸水平没有显著影响，但增加了精氨酸生物合成的中间底物，包括瓜氨酸、鸟氨酸、L-谷氨酸和 L-谷氨酰胺，这可能会加速 L-精氨酸的生物合成和利用。此外，GRc 增加了 ABC 转运蛋白组成中的山梨糖醇、阿洛糖、赖氨酸和羟脯氨酸，这些转运蛋白被广泛认为是反向胆固醇转运的受体，在预防和治疗 AS 中具有重要作用。牛磺酸被认为可以改善抗氧化作用和脂质分布并减少动脉粥样硬化病变的形成。牛磺酸的降胆固醇作用是由增强的胆固醇降解和胆汁酸排泄介导的。胆汁酸是 AS 中脂质、葡萄糖和能量代谢的重要信号分子和代谢调节剂。胆汁酸的粪便排泄是胆固醇的主要途径，在此过程中损失的胆汁酸需要由胆固醇从头合成来代替。此外，胆汁酸还显示通过肠道和肝脏中的法尼醇 X 受体 (FXR) 和武田 G 蛋白偶联胆汁酸受体 (TGR) 影响宿主脂质代谢。 CA 和 CDCA 等初级胆汁酸和石胆酸 (LCA) 和脱氧胆酸 (DCA) 等次级胆汁酸是 FXR 激动剂，而 LCA 和 DCA 是 TGR5 的激动剂。FXR 和 TGR5 的激活促进了能量代谢并显著减少了动脉粥样硬化的形成。我们的结果表明，GRc 治疗后胆固醇降低，牛磺酸、CA、CDCA、甘氨酸、isoLCA、TCDCA 和 TCA 水平升高。初级胆汁酸和次级胆汁酸的增加可能会加速肠肝循环和胆汁酸的粪便排泄以及 FXR 和/或 TGR5 的激活，然后加速胆固醇代谢，因为大多数 isoLCA 被排泄到粪便中并且少量被肝脏重新吸收。因此，GRc 治疗显著调节了 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠的粪便代谢物。GRc 缓解 AS 的潜在机制可能是由于改善了 CVD 相关的代谢途径，其中差异代谢物也被注释出来。这些结果在一定程度上证明了PICRUSt2对微生物群落的预测功能分析。总之，前面提到的粪便差异代谢物可能是 GRc 治疗 ApoE-/- 小鼠 AS 的潜在生物标志物。

先前的研究报道，Eubacterium_coprostanoligenes_group和颤杆菌可加重 CVD，而乳酸杆菌、双歧杆菌、Muribaculaceae和回肠杆菌则发挥保护作用，这意味着乳酸杆菌、双歧杆菌、Muribaculaceae 和回肠杆菌是有益于心血管健康的肠道菌群，而 Eubacterium_coprostanoligenes_group和颤杆菌起相反的作用。 GRc处理后，HFD诱导小鼠的动脉粥样硬化损伤得到缓解。此外，对心血管健康有益的肠道菌群增加，有害菌群减少，伴随牛磺酸和亚牛磺酸代谢中的粪便差异代谢物（牛磺酸和L-谷氨酸）增加，精氨酸生物合成（瓜氨酸、鸟氨酸和 L-谷氨酰胺）、ABC 转运蛋白（山梨糖醇、阿洛糖、赖氨酸和羟脯氨酸）、初级胆汁酸生物合成（CA、CDCA、TCA、TCDCA、GCDCA、isoLCA 和甘氨酸）和在嘌呤代谢（腺嘌呤和尿酸）、TCA 循环和胰高血糖素信号通路（富马酸、苹果酸、柠檬酸和氧代戊二酸）中代谢物的减少。我们研究了肠道代谢和 AS 之间的相关性。嘌呤代谢途径中的腺嘌呤和尿酸与肠道菌群Eubacterium_coprostanoligenes_group、Faecalibaculum和颤杆菌呈正相关，与AS指标（表面病变面积、TG和炎症因子）呈正相关，与肠道菌群乳酸杆菌、双歧杆菌和 Muribaculaceae呈负相关，这与之前的研究一致，即尿酸和腺嘌呤会加重 AS。

值得注意的是，之前的报道表明富马酸积累会加速炎症，苹果酸和柠檬酸可能是 AS 的危险因素。我们的研究表明，TCA循环中的富马酸、柠檬酸和苹果酸与肠道菌群（Eubacterium_coprostanoligenes_group、Faecalibacterium和颤杆菌）和AS指标呈正相关，与肠道菌群（乳酸杆菌、双歧杆菌、Muribaculaceae和回肠杆菌）呈负相关。ABC 转运通路中的代谢物与肠道菌群（乳酸杆菌、Muribaculaceae和回肠杆菌）呈正相关，与 AS 指标（表面病变面积、斑块面积、胶原蛋白面积、TC、TG、LDL-C 和 TNF-α）呈负相关。此外，精氨酸生物合成中的瓜氨酸与肠道菌群（Eubacterium_coprostanoligenes_group和颤杆菌）和AS指标呈负相关，而与Muribaculaceae和回肠杆菌呈正相关。在我们的研究中，鸟氨酸与 AS 指标（表面病变面积、斑块面积、胶原蛋白面积、TC、TG、LDL-C 和 TNF-α）呈负相关，而与肠道菌群（双歧杆菌、Muribaculaceae和回肠杆菌）呈正相关，支持了L-精氨酸及其代谢可以改善 AS 的观点。此外，增加的胆汁酸可能会加速胆汁酸的肠肝循环和粪便排泄以及 FXR 和/或 TGR5 的激活，然后加速胆固醇代谢并改善 AS。肠道菌群、胆汁酸和 AS 指标之间的相关性与前面提到的研究非常吻合，CDCA 与肠道菌群（Eubacterium_coprostanoligenes_group和Faecalibacterium）和 AS 指标（表面病变面积、TG 和炎症因子）呈负相关，而它与HDL-C呈正相关。甘氨酸与Eubacterium_coprostanoligenes_group 和 AS 指数呈负相关，与肠道菌群（双歧杆菌、Muribaculaceae和回肠杆菌）呈正相关。值得注意的是，isoLCA 与 Oscillibacter 和 AS 指数（表面病变面积和炎症因子）呈负相关，而与乳酸杆菌、双歧杆菌和 HDL-C 水平呈正相关。改变的肠道菌群、前面提到的粪便差异代谢物和动脉粥样硬化损伤显示出强烈的相关性。 Eubacterium_coprostanoligenes_group、Faecalibaculum、颤杆菌和经黏液真杆菌在 HFD 组中富集，表明与与动脉粥样硬化损伤正相关和与动脉粥样硬化损伤负调节物负相关的差异代谢物呈正相关。回肠杆菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属和鼠李氏杆菌科在 NC、GRc 和 Ato 组中富集，具有反向相关性。我们假设 GRc 治疗调节了与 CVD 相关的肠道微生物群的组成，随后粪便代谢特征从对心血管健康有害变为有益，最终缓解了 AS。在该研究中，我们首次报道了 GRc 在 HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中的抗动脉粥样硬化作用，并应用了 16S rRNA 序列和非靶向粪便代谢组学的综合分析方法，这可能为研究其他药物提供策略。我们还从肠道代谢的新角度探讨了 GRc 对抗 AS 的机制。该研究没有对结果进行验证，我们将继续进行进一步的实验，例如在无菌小鼠中进行粪便移植。

结论

在这项研究中，GRc 在HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中减少了动脉粥样硬化病变，改善了血脂水平和全身炎症，而小鼠体重没有显著变化。考虑到 GRc 在口服给药中的生物利用度较差，GRc 可能通过调节肠道菌群和与心血管疾病密切相关的差异表达粪便代谢物的综合作用发挥抗动脉粥样硬化的作用。我们的研究首次报道了 GRc 在HFD 诱导的 ApoE-/- 小鼠中的抗动脉粥样硬化作用。然而，血清中的代谢物以及受 GRc 调节的其他一些肠道菌群的作用仍有待阐明。

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.990476/full

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