细菌耐药性严重影响了传统化疗药物对细菌感染的治疗效果。细菌可以利用多种策略直接避免经典抗生素治疗产生的生长抑制，包括酶失活和靶点修饰。然而，近年来研究发现，越来越多的病原菌除了自我调节外，还适应了宿主细胞内的生活方式，从而避免了与抗菌药物的接触。这些胞质细菌通常通过重编程宿主代谢、干扰降解途径和抑制炎症来损害固有免疫，目的是获得细胞内增殖龛。宿主细胞和致病菌之间的这种相互作用也可能引发抗生素使用后的扩增和复发/持续感染，因此发现和开发替代疗法迫在眉睫。

日前，香港中文大学唐本忠院士、深圳大学王东教授和广州医科大学李莹副研究员合作设计并简单地合成了一种新的D-π-A型发光剂，具有强的红色/近红外荧光发射、大的聚集诱导发射（AIE）特性和优良的活性氧（ROS）产生（图1）。新开发的分子TTTh通过触发细菌内ROS积累和破坏膜完整性来杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。此外，TTTh还能特异性地靶向溶酶体并促进其成熟，从而加速细胞内细菌的清除。此外，TTTh治疗的伤口减少了细菌负荷，促进了愈合，且副作用很小。本研究拓展了AIE发光原（AIEgens）的生物设计和应用，为发现新型抗菌靶点和药物提供了新的思路。相关工作以“Double-pronged Antimicrobial Agents based on a Donor-π-Acceptor Type Aggregation-Induced Emission Luminogen”发表在《 Angewandte Chemie International Edition》。

图1. TTTh的分子结构和作用机制

TTTh的光物理性质

研究者首先研究了新型荧光剂TTTh的光物理性质。TTTh在二甲基亚砜溶液中的最大吸收峰和发射峰分别为483 nm和652 nm（图2A）。纯TTTh DMSO溶液表现出非常微弱的荧光发射，最大强度位于652 nm（图2B），这主要归因于溶液态中灵活的分子旋转导致激发态通过非辐射途径的能量消耗。同样，甲苯在混合溶剂中的比例增加，导致荧光强度急剧上升，这是由于旋转运动受到强烈限制，并伴随着聚集物的形成（图2B-C）。研究者进一步检测TTTh在PBS中的总ROS生成，以检测新型荧光素在聚集态下的光动力学活性。有趣的是，TTTh比Ce6表现出更强的产生所有三种ROS的能力，而在TTTh存在的情况下，比RB检测到更多的O 2 −•和 1O 2（图2D-F），这表明TTTh有效地产生了i型和ii型ROS。此外，通过自旋诱捕剂5,5-二甲基-1-吡咯啉- n-氧化物（DMPO）和基于4-氨基-2,2,6,6 -四甲基哌啶（TEMP）的电子自旋共振（ESR），进一步验证了TTTh在光照下的•OH（图2G）、O 2 −•（图2H）和 1O 2（图2I）的强生成。为了阐明TTTh具有更强的ROS生成能力，研究者使用基于时间依赖密度泛函理论(TD-DFT)的Gaussian09进行理论计算。空穴NTOs主要分布在2-(4-(1,2,2 -三苯基乙烯基)苯基)噻吩核心上，而电子NTOs位于3-乙基-2-乙烯基苯并[d]噻唑-3-铵单元上（图2J）。进一步计算了TTTh的单线态和三线态能级。计算TTTh在S1和T1之间的SOC值为0.18 cm -1，表明TTTh的ROS生成可能发生从S1到T1的高效ISC过程（图2J）。综上所述，新荧光素TTTh被鉴定出具有良好的AIE性质和光动力活性。

图2. TTTh的光物理性质

TTTh特异性靶向溶酶体，显著提高细胞中ROS的积累

TTTh在巨噬细胞RAW264.7和内皮细胞HUVEC的点状溶酶体中精确聚集（图3A），TTTh通道(红色)的荧光信号与LysoTracker通道(绿色)的荧光信号有较好的重叠。这表明TTTh对溶酶体具有显著的选择性。有趣的是，TTTh处理半小时不光照没有观察到ROS的积累，而仅光照10 min则略微增加了巨噬细胞和内皮细胞中ROS的含量（图3B-C）。更重要的是，大多数TTTh标记的细胞在光照后都观察到明亮的绿色荧光（图3B）。在接受2 μM TTTh处理的内皮细胞和巨噬细胞中，光暴露的对照组的强度分别增加了约10倍和8倍（图3C），表明TTTh在细胞内具有高效的光动力学活性。

图3. TTTh特异性靶向溶酶体，显著诱导内皮细胞和巨噬细胞中ROS的积累

TTTh的杀菌作用

为了阐明TTTh的潜在抗菌活性，研究者研究了TTTh与病原菌的直接相互作用。MRSA作为一种革兰阳性菌，TTTh也可以在5分钟内被染色(图4A)。值得注意的是，当TTTh分别作用于1 μM或5 μM时，超过99%的金黄色葡萄球菌29213和MRSA被杀灭（图4B）。虽然TTTh不能阻止金黄色葡萄球菌29213和MRSA的生长，但细菌对数期的开始在光照后大大延迟了2 ~ 16 h（图4C）。有趣的是，FESEM显示了细菌细胞壁的明显塌陷（图4D），而FEHR-TEM图像显示，治疗后MRSA的细胞壁和细胞膜既不平整也不尖锐（图4E）。为了明确TTTh对金黄色葡萄球菌细胞膜的影响，研究者检测了TTTh处理后的细胞膜电位和细胞膜通透性。值得注意的是，TTTh剂量依赖性地触发了MRSA的超极化和膜扰动（图4F-H）。此外，由于膜损伤导致的ROS过度产生会进一步加重细菌的膜损伤，在光照前后MRSA中ROS含量呈时间和剂量依赖性增加(图4I)，表明TTTh引起了严重的膜功能障碍。综上所述，该结果表明TTTh通过快速产生ROS和对细胞膜的持续损伤直接清除金黄色葡萄球菌。

图4. TTTh对金黄色葡萄球菌的杀菌作用

TTTh对金黄色葡萄球菌的宿主直接抗菌作用

接下来，为了研究TTTh对宿主的抗菌活性，特别是TTTh对溶酶体和溶酶体介导的对细胞内细菌的杀伤作用，研究者首先用不同浓度的TTTh处理金黄色葡萄球菌29213，然后是巨噬细胞的侵袭（图5A）。此外，为了阐明TTTh对细胞内金黄色葡萄球菌的直接抗菌作用，研究者先用pHrodo标记的金黄色葡萄球菌感染巨噬细胞，然后进行TTTh治疗（图5A）。该结果表明，TTTh剂量依赖性地限制了细胞内细菌的持续存在，并增强了巨噬细胞的抗菌活性（图5B-C）。研究者进一步研究TTTh如何增强巨噬细胞的杀菌活性。TTTh不影响溶酶体质量和生物发生（图5E-F）。令人惊讶的是，1-2 μM TTTh显著促进了总CTSD和活性CTSD的产生，以及黑暗中CTSD的成熟部分(图5E-F)，这表明TTTh通过促进CTSD在含有病原体的液泡中积累来增强内化金黄色葡萄球菌的清除。

图5. TTTh对金黄色葡萄球菌的宿主直接抗菌作用

TTTh加速了伤口的愈合过程和细菌的清除

为进一步验证TTTh的体内抗菌活性，研究者构建小鼠背部皮肤细菌感染创面动物模型。与PBS组相比，TTTh和光照处理小鼠后，可以观察到金黄色葡萄球菌29213和MRSA感染的创面面积更小（图6A-B）。与PBS组相比，TTTh组感染金黄色葡萄球菌29213后7 d创面细菌负荷下降超过99.9%，而感染MRSA后5、7和10 d创面细菌数量下降近90%（图6C）。表明TTTh可加速金黄色葡萄球菌29213和MRSA感染创面的细菌清除和组织修复。

图6. TTTh加速了伤口的愈合过程和细菌的清除

小结：研究者研制了一种具有良好的AIE特性和光动力活性的D-π-A型发光素TTTh。TTTh不仅能特异性结合并示踪具有良好生物相容性的哺乳动物细胞溶酶体，还能在体内外促进MRSA的清除。TTTh通过破坏膜完整性和诱导细菌内ROS积累来杀死胞外的MRSA。此外，TTTh通过增强巨噬细胞溶酶体酸化和成熟，显著减少细胞内MRSA的数量。TTTh的应用显著降低了MRSA感染创面的细菌负荷，加速了MRSA感染创面的愈合进程。该研究结果拓展了AIEgens的生物学应用，为抗菌靶点的发现和药物的开发提供了思路。

原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202212386

来源：高分子科学前沿

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