微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

西洋参提取物(AGE)是一种高效、低毒的2型糖尿病(T2DM)佐剂。然而，AGE改善T2DM的代谢机制仍然未被阐述清楚。在这项研究中，我们构建并实施了28天的T2DM大鼠模型，收集它们的生物学（体重和血清生化指标）和病理学（用HE染色的胰腺切片）信息用于进一步的药效学评估。此外，一种基于超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS/MS-based）的非靶向代谢组学方法被用于鉴定所有大鼠血清样本和相关代谢途径的潜在生物标志物。结果表明，体重、空腹血糖（FBG）、空腹血胰岛素（FINS）、血甘油三酯浓度（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和胰岛素敏感性指数（ISI）和受损的胰岛细胞在高剂量AGE（H_AGE）和二甲双胍处理后明显改善。代谢组学分析确定了101个潜在的生物标志物，其中94个代谢物具有明显的回调。这些潜在的生物标志物主要富集在与氨基酸代谢和脂质代谢相关的九种代谢途径中。我们进一步探讨了色氨酸代谢和谷胱甘肽代谢作为AGE和二甲双胍改善T2DM的差异代谢途径。对上述结果的进一步分析表明，AGE的抗T2DM作用与炎症、氧化应激、内皮功能障碍、血脂异常、免疫反应、胰岛素抵抗、胰岛素分泌和T2DM相关并发症密切相关。本研究可为系统探索AGE改善T2DM作用机制提供有力支持，为临床诊断T2DM提供依据。

论文ID

原名：Study on the mechanism of American ginseng extract for treating type 2 diabetes mellitus based on metabolomics

译名：基于代谢组学的西洋参提取物治疗2型糖尿病机制研究

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF：5.988

发表时间：2022.09

通讯作者：吴晓辉 & 崔妍

通讯作者单位：天津医科大学

实验设计

实验结果

1. AGE中的人参皂苷

我们采用高效液相色谱技术测定AGE中主要人参皂苷的含量。以下分别代表这些人参皂苷的含量（%）：Rb1（8.69），Re（3.34），Rd（1.36），Rc（0.96）和Rg1（0.58）（补充图S1）。

图1 对照、模型和药物处理大鼠的体重变化。注：数据表示为平均值±标准差（n = 6）；BT：处理前；AT：处理后。

2. 体重观察结果

图1描绘了给药期间各组体重变化趋势。对照组和二甲双胍组大鼠体重逐渐增加。模型大鼠体重先增加后缓慢下降。与模型组相比，低剂量西洋参提取物（L_AGE）组和高剂量西洋参提取物（H_AGE）组体重变化呈现明显相反的趋势。

表1 与AGE处理相关的代谢途径

3.生化检测结果

我们评估或计算血清样品中FBG、FINS、TG和HDL-C的水平以反映给药的功效。图2A-F显示，与模型大鼠相比，AGE和二甲双胍改善了上述生化指标。与AGE组相比，二甲双胍组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR指数调节较好；与二甲双胍大鼠相比，AGE大鼠的HDL-C、TG和ISI指数得到更好的调节。

图2 各组血清生化标志物水平。(A-F)分别代表血清样品中空腹血糖(FBG)、空腹血胰岛素(FINS)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血甘油三酯浓度(TG)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的水平和胰岛素敏感性指数（ISI）。注：数据表示为平均值±标准差（n = 6）；学生t检验：与对照组相比，****p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01，和 *p < 0.05；与模型组相比，####p < 0.0001、###p < 0.001、##p < 0.01、#p < 0.05。

4. 胰腺切片结果

为了验证AGE的保护作用，我们观察了胰腺切片中胰岛的形态和大小（图3）。与对照组相比，模型大鼠的胰岛细胞数量较少，体积更小，形态更不规则，空泡变性。L_AGE组大鼠胰岛与模型大鼠无显著差异。与模型大鼠相比，二甲双胍组和H_AGE组胰岛形态更规则，胰岛细胞数量较多，无空泡变性，相较于对照组，药物处理组水平恢复率约40%~50%。

图3 大鼠胰腺组织H&E染色病理变化(×400)。

5.血清样品代谢组学

5.1 UHPLC-MS /MS分析的稳定性

我们在正离子和负离子模式下获得质量控制(QC)样品的总离子色谱图 (TIC)。以样品QC01为例，TIC（补充图S2）始终显示出良好的峰形和相对均匀的分布，从而验证了LC-MS系统在整个检测过程中是稳定的。

图4 来自对照、模型和药物处理大鼠的样本在ESI +模式(A)或ESI-模式(B)下的PCA评分图。来自对照、模型和药物处理大鼠的样本在ESI+ (C)或ESI- (D)模式下PLS-DA评分图。椭圆表示置信区间为95%。

5.2 多元统计分析

为了更好地揭示不同组样本之间的区别，我们同时采用了PCA和PLS-DA方法。图中点的距离越近，样品的代谢物表达模式越相似。如图4A-D所示，模型大鼠和对照大鼠的样本之间存在明显的分离；药物处理组和模型组代谢物样品也有明显偏差；与H_AGE大鼠相比，二甲双胍大鼠的样本与对照大鼠的样本位置上更接近，提示二甲双胍的疗效比H_AGE更显著；H_AGE大鼠的样本比L_AGE大鼠样本更接近对照大鼠的样本，这表明H_AGE对T2DM的疗效比L_AGE更显著。

与PLS-DA相比，OPLS-DA可以极大地区分两组之间的差异，提高模型的有效性和分析能力。因此，我们采用OPLS-DA方法分析对照与模型以及模型与H_AGE组样本的代谢组学数据。图5A-D和补充图S3A-D显示了结果。OPLS-DA的得分图显示了上述两对组之间明显分离。我们使用7次交叉验证方法得到OPLS-DA模型的R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)，验证其可靠性。这些参数越倾向于1，模型越可靠。Q2 > 0.5表明OPLS-DA模型具有良好的预测能力。对于从对照组和模型组获得的OPLS-DA模型，正离子模式下这三个参数分别为0.435、0.994和0.91，而负离子模式下这三个参数分别为0.509、0.994和0.924。此外，我们使用200响应置换检验(RPT)来评估OPLS-DA模型的准确性，其中左侧R2和Q2值小于右侧初始值，表明模型可用。

火山图（图5E、F以及补充图S3E、F）显示了模型组与对照组以及H_AGE与模型组中差异代谢物表达的变化趋势。每个点代表一个特定的代谢物，点的大小表示 VIP 值。圆点越大，VIP值越大。红点是指下调的代谢物，蓝点是指上调的代谢物。

图5 正离子模式(A)或负离子模式(B)中对照与模型样本的OPLS-DA评分图；OPLS-DA 模型的7次交叉验证图，在正离子模式(C)或负离子模式(D)下进行了200次置换测试；正离子模式(E)或负离子模式(F)下对照与模型的火山图。椭圆表示置信区间为95%。

5.3潜在生物标志物识别

在VIP > 1.0、p < 0.05的阈值下，我们分别确定了204种差异代谢物（模型与对照）、224种差异代谢物（二甲双胍与模型）、173种差异代谢物（L_AGE与模型）和191种差异代谢物（H_AGE与模型）。通过重叠模型组与对照组以及二甲双胍组与模型组之间的差异代谢物，我们共获得111种交叉代谢物。通过重叠模型组与对照组以及H_AGE与模型组之间的差异代谢物，我们筛选了总共106种交叉代谢物。在这106种代谢物中，101种显著差异代谢物可以通过HMDB或KEGG数据库进行搜索，并被视为AGE改善T2DM的潜在生物标志物（补充表S1）。与模型组相比，H_AGE组94个潜在生物标志物的表达显著反向调节。图6以热图的形式直观地展示了对照、模型、H_AGE和二甲双胍组血清样本中101个潜在生物标志物（49个来自ESI +模式和52个来自ESI-模式）的相对表达。

5.4 代谢组学通路结果

为了探索AGE改善T2DM的潜在生物标志物、代谢途径和代谢机制之间的关联，我们对模型与对照组以及H_AGE与模型组之间的106种交叉代谢物进行了通路富集（图7A）。p < 0.05和影响值> 0.1的代谢途径被认为是最重要的途径，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸生物合成、色氨酸代谢以及D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢（表1）。在这些重要途径中富集的代谢物可能是最重要的潜在生物标志物，包括L-谷氨酸、牛磺酸、3-亚磺基丙氨酸、5-羟基L-色氨酸、5-甲氧基吲哚乙酸和D-鸟氨酸。为进一步探讨AGE与二甲双胍改善T2DM的代谢途径及作用机制的差异，我们还对模型组与对照组以及二甲双胍组与模型组之间的111种交叉代谢物进行了通路富集分析（图7B）。值得注意的是，与二甲双胍不同，AGE还通过改善色氨酸代谢和谷胱甘肽代谢紊乱发挥其抗T2DM作用。

图6 潜在生物标志物的热图。行：生物标志物；列：样本。这张图片中的阴影描绘了每组样本中代谢物的相对表达量。红色描绘生物标志物的表达增加，蓝色描绘生物标志物的表达减少（Mod vs. Con；Met vs. Mod；H_AGE vs. Mod）。

2型糖尿病是一种发病机制复杂的代谢综合征，主要导致碳水化合物、脂质和蛋白质代谢紊乱。目前，许多具有生物活性的中药材（TCHMs）被广泛用于2型糖尿病的治疗，有望成为其替代疗法。代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，有助于确认这些中药的安全性和有效性，探索它们的潜在作用机制和潜在的生物标志物，并进一步确定这些中药的靶点。此外，代谢组学可以揭示干预后整个系统的代谢特征，符合TCHMs的总体理念，有利于其现代研究。因此，我们试图通过代谢组学技术研究AGE对抗T2DM的代谢机制。

图7 代谢途径分析。(A)指Mod vs Con和H_AGE vs Mod之间的交叉代谢物的通路富集分析。(B)指Mod vs Con和Met vs Mod之间的交叉代谢物的途径富集分析。X轴代表影响值，Y轴代表-log10（p值）。气泡的大小代表影响值。气泡越大，-log10(p-value)越高，通路的重要性就越大。


在本研究中，基于药效学评价结果，我们发现AGE可以通过改善T2DM大鼠的血脂水平和保护胰岛发挥其显著功效。代谢组学结果表明，H_AGE可以通过调节101个潜在的生物标志物来极大地逆转T2DM大鼠的代谢紊乱。此外，通路富集和KEGG拓扑分析表明AGE的抗T2DM机制与调节氨基酸和脂质代谢紊乱密切相关。在此，我们旨在通过研究一些特殊的潜在生物标志物和代谢途径来探索AGE改善T2DM的潜在机制。

先前的一项研究表明，西洋参可以增加肉碱的含量，有助于恢复体内脂质代谢紊乱。然而，研究者们发现丁酰左旋肉碱（BC）作为肉碱的一种丁酸酯，可以产生丁酸酯和肉碱，且主要通过肉碱转运蛋白OCTN2和氨基酸转运蛋白ATB0,+来缓解肠道炎症。此外，丙酰肉碱(PC)是左旋肉碱的一种类似物，可缓解患有PAD的T2DM患者的外周血管疾病（PAD）相关症状并降低血糖水平。一项实验还表明，PC可以改善糖尿病大鼠心脏功能并增强其缺血耐受性。处理后BC和PC的表达上调，说明AGE和二甲双胍有利于糖尿病大鼠减轻炎症，改善心功能。γ-生育三烯酚是不饱和维生素E的异构体，它可以通过抑制核因子kappa-B (NF-κB)和Nod样受体3 (NLRP3)炎性体来缓解脂肪组织炎症并维持胰岛素敏感性。与模型组相比，H_AGE和二甲双胍组γ-生育三烯酚的表达上调，证明H_AGE和二甲双胍的抗T2DM作用可能与炎症密切相关。

代谢组学数据显示溶血磷脂酰胆碱(lysoPCs)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysoPEs)和磷脂酰胆碱(PCs)的含量预计为lysoPC(20: 5 (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)), PC(18:1 (9Z)/18:1 (9Z)),PC(14:0/20:1 (11Z))和PC(18:0/18:2 (9Z,12Z)在模型大鼠中下调，在AGE大鼠中上调，表明脂质代谢可能在AGE改善T2DM中起重要作用。一项研究还表明，与T2DM患者相比，患有心血管疾病(CVD)T2DM患者的这些脂质水平下调，表明这些脂质的表达与T2DM患者心血管疾病的风险呈负相关。此外，之前的研究表明，lysoPCs和lysoPEs可以作为与炎症和氧化应激相关的循环代谢中间体来预测早期糖尿病的风险。之前的一份报告显示，lysoPC可以在调节血管内皮扩张、细胞免疫反应和胰岛素分泌中发挥重要作用。磷脂酰胆碱(PC)是富含在内质网中最重要的磷脂，参与脂质储存/分泌、应激反应和糖尿病的发生；Wang等人表明，胆碱、三甲胺N-氧化物(TMAO)和甜菜碱作为膳食脂质磷脂酰胆碱的三种代谢物，有助于预测心血管疾病(CVDs)的风险。

反式白藜芦醇3,4'-二硫酸盐属于一类称为二苯乙烯类的有机化合物。二苯乙烯是重要的多酚类化合物，具有多种药理活性，如抗炎、抗糖尿病和抗血脂，对血管生成、炎症和细胞增殖具有显著的调节作用。H_AGE和二甲双胍处理后反式白藜芦醇3,4'-二硫酸盐的表达显著增加，表明该化合物可能在AGE和二甲双胍抗T2DM中起重要作用。

色氨酸代谢是参与调节炎症相关疾病的重要代谢途径。L-色氨酸（色氨酸）可以降低T2DM大鼠的血糖水平并保持正常的胰岛素分泌。5-羟基-L-色氨酸(5-HTP)，作为5-羟基-色胺(5-HT)生物合成的直接前体，在T2D供体胰岛分离出的葡萄糖刺激下，可以抑制非糖尿病胰岛供体胰岛素和胰高血糖素的分泌，并显著增加胰岛素的释放。在我们的研究中，色氨酸代谢途径中富集的5-HTP在模型大鼠中下调，在H_AGE大鼠中上调，表明H_AGE可能通过调节色氨酸代谢来促进胰岛素分泌。谷胱甘肽（γ-谷氨酰-半胱氨酸甘氨酸）属于由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成的一类低分子量硫醇。谷胱甘肽缺乏极有可能导致T2DM的发展。谷胱甘肽代谢在抑制氧化应激中起关键作用，半胱氨酰甘氨酸在二肽酶的催化下可分解为半胱氨酸和甘氨酸。我们的研究发现半胱氨酸和L-谷氨酸在谷胱甘肽代谢途径中富集。与模型组相比，H_AGE组的半胱氨酰甘氨酸水平较低，L-谷氨酸水平较高，表明AGE可能通过促进半胱氨酸、甘氨酸和L-谷氨酸的产生进一步合成谷胱甘肽，从而抑制T2DM的进程。

L-精氨酸（精氨酸）作为内皮细胞产生NO的底物，可有效治疗心血管危险因素引发的内皮功能障碍。它可以通过作用于电压门控Ca2+通道来刺激胰岛素的产生，并通过转化为L-谷氨酸促进胰岛素的分泌。L-谷氨酸作为一种在体内丰富的非必需氨基酸和代谢的底物，来源于生物合成和食物摄入，以及增强胰岛素分泌。Han等人认为，从谷氨酰胺转化而来的谷氨酸在谷氨酰胺对胰岛素分泌的放大作用中是钙信号增强的重要介质。我们观察到模型大鼠的L-谷氨酸含量下调，H_AGE和二甲双胍处理后显著上调，表明AGE可能通过调节与L-谷氨酸相关的多种代谢途径来刺激胰岛素分泌。

牛磺酸是一种存在于所有哺乳动物组织中的丰富氨基酸，可通过降低血清瘦素水平和胰岛素抵抗来改善糖代谢和脂代谢紊乱。越来越多的证据表明，牛磺酸可以通过抑制氧化应激和炎症对糖尿病及其并发症产生有益的影响。H_AGE和二甲双胍处理后牛磺酸水平升高，表明H_AGE通过干扰牛磺酸和亚牛磺酸的代谢发挥其功效，这与过去的研究一致。鸟氨酸是精氨酸酶的酶促作用产生的中间体化合物，通过尿素循环合成尿素。一项基于医院的横断面研究显示，T2DM与尿素循环中的鸟氨酸水平呈负相关，这与我们目前的结果一致。一项研究表明，参与尿素循环的氨基酸与炎症和氧化应激有关。这些事实表明，H_AGE和二甲双胍可能主要通过调节氨基酸代谢发挥抗炎和抗氧化作用。

TOFA (5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid)是一种有效的降血脂剂，可显著抑制脂肪酸合成，刺激脂肪酸氧化，减少甘油三酯合成。此外，据报道，a-萜品醇可以通过调节AMPK/mTOR/SREBP-1通路来增加脂质水平。与模型组相比，H_AGE和二甲双胍可以显著提高TOFA含量，降低a-萜品醇含量，表明H_AGE和二甲双胍可能通过降低血脂水平发挥其抗T2DM作用。哌啶酸是一种源自赖氨酸分解代谢的非蛋白质氨基酸，对调节人类和植物的免疫至关重要。已有研究表明，哌啶酸是多种植物防御反应的关键调控因子，参与了免疫信号水杨酸(SA)的产生、抗菌代谢产物的积累和防御基因的转录。H_AGE和二甲双胍大鼠体内较高的D-哌啶酸水平表明AGE和二甲双胍可能通过增加D-哌啶酸含量来增强机体免疫反应。

结论

本研究最终通过生化分析和胰腺切片分析验证了AGE和二甲双胍对T2DM的疗效。基于UHPLC-MS/MS的非靶向代谢组学技术和多变量统计分析，我们发现AGE可以通过调节94种潜在的生物标志物含量而具有显著的抗T2DM作用。富集分析表明，AGE主要影响D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸生物合成和色氨酸代谢、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢的代谢紊乱。进一步分析表明，AGE的抗T2DM机制主要与抑制炎症、氧化应激、内皮功能障碍、血脂异常、胰岛素抵抗、T2DM相关并发症和增强免疫反应、胰岛素分泌有关。我们的研究首次从代谢的角度系统地阐明了AGE改善T2DM的潜在生物标志物和机制，可为T2DM的新药研发和临床诊断提供参考。

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.960050/full

【福利时刻】

扫码联系购买

毕业季找工作点击链接，多家企业30W+年薪工作招聘任你选（赶紧点击进入注册，上传简历吧~ ） 。