2022年11月04日，海军军医大学侯晋及曹雪涛共同通讯在Journal of Hematology & Oncology 在线发表题为 JMJD4-demethylated RIG-I prevents hepatic steatosis and carcinogenesis 的研究论文，该研究通过DEN诱导的肝癌发生模型及STAM-NASH诱导的肝癌发生模型研究了RIG-I分子对于肝癌（HCC）发生的不同调控作用，并使用免疫沉淀联合质谱试验鉴定了介导RIG-I去甲基化修饰的分子JMJD4，并验证了其在调控肝癌发生中的作用。本研究发现，在DEN诱导的肝癌发生模型中，RIG-I敲除能够促进肝癌发生，而在NASH诱导的肝癌发生模型中，RIG-I敲除却能够抑制肝癌发生。此外，炎症细胞因子IL-6能够介导肝癌祖细胞（HcPCs）中RIG-I分子蛋白水平的下调，从而促进IL-6信号通路激活，进而促进HcPCs发展为HCC。高脂饮食（HFD）能够上调RIG-I分子的蛋白水平，从而促进胆固醇的合成及脂肪变性，进而导致NASH及NASH诱导的肝癌发生。

机制上，在正常肝细胞中，RIG-I分子在K18位及K146位存在组成性的单甲基化修饰，而去甲基化酶JMJD4能够对RIG-I分子K18位及K146位进行去甲基化，去甲基化的RIG-I分子能够反馈性抑制IL-6-STAT3信号通路。而K18及K146位单甲基化的RIG-I分子能够竞争性结合AMPKα，从而抑制HMGCR的磷酸化，进而促进HMGCR的酶活性，促进胆固醇合成。在临床组织样本中，RIG-I分子蛋白水平在肝脏癌前病变异常增生结节中表达下调，但在脂肪肝组织中上调，这与在小鼠模型中获得的结论一致。总之，肝癌祖细胞中RIG-I蛋白水平的下调可促进坏死性炎症诱导的肝癌发生，而肝脏组成性甲基化的RIG-I分子能够促进肝脏脂肪变性及NASH诱导的肝癌发生。JMJD4分子介导的RIG-I分子去甲基化不仅能够抑制坏死性炎症诱导的肝癌发生，还能够抑制NASH诱导的肝癌发生，这为临床预防肝癌发生提供了机制见解和潜在靶点。

肝细胞肝癌是最常见且最常引起癌症相关死亡的肿瘤之一。病毒感染、酗酒以及肝脏内脂质累积引起的肝脏炎症在肝癌发生中扮演重要作用。肝细胞的损伤和死亡能够诱导肝内免疫细胞的激活，介导肝细胞的代偿性增殖，进而促进肝细胞的恶性转化，即完成肝癌祖细胞（HcPCs）到肝癌细胞（HCC）的转变。然而，介导肝细胞恶性转化机制仍不甚清楚。因此，探究免疫炎症及其在肝癌发生中的调控作用具有十分重要的科学意义及临床研究价值。从机制上讲，损伤及死亡的肝细胞能够向周围释放大量的死亡相关分子模式（DAMPs），其可通过Toll样受体（TLR）信号传导激活肝内驻留巨噬细胞，并招募外周巨噬细胞。随后，促进巨噬细胞分泌促炎细胞因子如白细胞介素6（IL-6），IL-6的释放能够引发肝脏炎症，进而导致肝细胞的代偿性增殖，从而修复肝脏损伤。然而，循环往复的肝脏损伤会导致肝内慢性炎症，并介导炎症诱导的肝癌发生，而促炎细胞因子IL-6及其下游致癌IL-6信号STAT3通路在此过程中发挥关键作用，尤其在HcPCs向HCC转变过程中，HcPCs可通过自分泌IL-6促进其恶性转化。因此IL-6的产生以及其下游效应信号通路均与肝癌发生密切相关，且受到多种机制调控，在HcPCs中IL-6效应信号是否被调控及如何被调控目前仍然未知。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）以肝内被大量甘油三酯及胆固醇聚集为特征。NAFLD患者常患肝脂肪变，严重时可进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），NASH患者以肝内慢性损伤、炎症及肝纤维化为特征。如不施加干预，NAFLD及NASH患者会进展为肝硬化，并最终发展为肝癌。在此过程中，肝内脂质的累积及肝脂肪变是疾病发展中的第一步，一系列机制在其中发挥调控作用，包括甾醇调节元件结合蛋白（SREBPs）的激活及其下游多种代谢酶分子均在其中发挥作用。然而，关于脂质合成的调控及其在肝脂肪变、NASH及NASH诱导的肝癌发生中的调控机制仍有待于进一步深入研究。

RIG-I分子是胞内识别病毒双链RNA的模式识别受体，其在介导I型干扰素的产生及抗病毒天然免疫中发挥重要作用。RIG-I分子包含一个C端的解螺旋结构域，负责识别胞内病毒RNA双链，以及两个N端串联半胱天冬酶募集结构域（CARDs），负责介导下游I型干扰素的产生。RIG-I分子除了在免疫细胞中表达外，该团队前期研究发现，在肝脏中，RIG-I分子主要表达于肝脏实质细胞而非肝脏间质细胞，这提示RIG-I在肝脏及肝脏疾病中可能发挥作用。然而，在肝脏代谢、肝脂肪变及肝癌发生，尤其是在肝癌发生的不同阶段，如肝脂肪变、肝脏损伤、炎症、代偿性增殖及HcPCs中，RIG-I分子的作用仍然未知。

蛋白的翻译后修饰（PTM），如磷酸化、泛素化、乙酰化及甲基化修饰能够调控蛋白的功能及蛋白稳定。例如，研究表明RIG-I分子S8、S854、S855、T170及T770的磷酸化修饰，K99、K169、K172及K788的K63泛素化修饰，K813的K48泛素化修饰以及K909的乙酰化修饰在RIG-I分子的识别、激活、蛋白相互作用及降解中均发挥重要作用。并且，目前研究发现，蛋白甲基化作为一种重要的蛋白翻译后修饰方式，不仅在组蛋白甲基化修饰介导的转录抑制和激活中发挥作用，在非组蛋白中，蛋白甲基化修饰也能通过蛋白-蛋白相互作用影响蛋白功能。然而，RIG-I分子是否存在甲基化或去甲基化，这种修饰是否能够调控RIG-I分子蛋白功能，目前仍然未知。

首先，研究团队在DEN诱导的肝癌发生模型中检测发现，RIG-I分子的表达水平在HcPCs中发生下调，进一步研究验证，发现促炎细胞因子IL-6介导了这一现象发生。随后，在DEN诱导的肝癌发生模型及DEN联合CCl4诱导的肝癌模型中发现，肝细胞特异性敲除RIG-I分子能够促进肝癌的发生。进一步研究发现，HcPCs中RIG-I分子的敲除或表达水平下调能够增强IL-6-STAT3效应信号通路，进而促进HcPCs向HCC的恶性转化。在机制研究中，研究团队发现，RIG-I的N端CARDs结构域能够与JAK2的JH2结构域竞争性结合，从而抑制JAK2对STAT3分子的磷酸化。同时，IL-6能够诱导RIG-I分子K18位及K146位发生去甲基化修饰，而RIG-I分子的去甲基化能够增强自身与JAK2分子的结合进而反馈性抑制STAT3分子的磷酸化活化，这一结论在点突变小鼠（K18A+K146A小鼠及K18M+K146M小鼠）中得到验证，与之对应，在点突变小鼠中，DEN诱导的肝癌发生也发生相应变化。通过IP-MS技术，研究团队鉴定了介导RIG-I去甲基化的分子JMJD4，构建了肝细胞特异性JMJD4敲除小鼠，并验证了JMJD4确实能够介导IL-6诱导的RIG-I分子去甲基化。发现JMJD4介导RIG-I去甲基化能够增强RIG-I分子与JAK2分子的结合，进而能过够抑制IL-6-STAT3效应信号通路的过度活化。通过构建肝细胞特异性RIG-I和JMJD4双敲除小鼠，肝细胞特异性JMJD4敲除-RIG-I K18A+K146A点突变小鼠，并使用DEN诱导的肝癌发生模型研究，发现在坏死性炎症介导的肝癌发生中，RIG-I分子促进肝癌发生依赖于去甲基化酶JMJD4分子。

其次，与上述研究相反，在STAM-NASH诱导的肝癌发生模型中，肝细胞特异性敲除RIG-I分子能够抑制NASH诱导的肝癌发生。与之相对应，在NASH诱导模型中（MCD模型及CD-HFD模型），肝细胞特异性敲除RIG-I分子能够明显抑制小鼠NASH的发生，表明RIG-I敲除能够抑制NASH及 NASH诱导的肝癌发生。肝脂肪变、脂肪性肝炎、肝硬化及肝癌是NASH诱导的肝癌发生的不同疾病发展阶段。肝脂肪变性是这一疾病发展过程的始发病理变化。因此，本研究团队通过高脂饮食模型（HFD模型）探究了RIG-I在肝脂肪变中的作用。研究发现，肝细胞特异性敲除RIG-I分子能够明显缓解高脂饮食诱导的肝脂肪变，尤其是能够明显降低肝脏内胆固醇的堆积。此外，肝细胞特异性RIG-I敲除还能够降低外周血内胆固醇的水平，并抑制小鼠外周动脉的粥样变性。同时研究发现，RIG-I蛋白水平在肝脂肪变中发生上调，而在NASH中发生下调。在机制研究中发现，K18及K146位甲基化的RIG-I分子能够通过竞争性结合AMPKα分子来抑制HMGCR分子的磷酸化，进而促进其酶活性，促进胆固醇的合成。而IL-6诱导的RIG-I分子的去甲基化则能够抑制肝脏内胆固醇的合成。这一结论在点突变小鼠（K18A+K146A小鼠及K18M+K146M小鼠）及肝细胞特异性JMJD4敲除小鼠中得到验证，RIG-I分子的去甲基化能够通过抑制肝脂肪变进而抑制NASH及NASH诱导的肝癌发生，这一过程仍依赖于JMJD4分子。

最后，研究团队在人临床样本中对RIG-I分子及其甲基化水平、JMJD4分子、STAT3磷酸化水平以及HMGCR磷酸化水平进行了检测，并在临床队列中对其表达水平和临床预后进行统计分析，发现在肝癌患者中，具有高RIG-I及高JMJD4表达水平的患者预后最佳，提示RIG-I和JMJD4分子联合能够更好预测患者预后，且JMJD4介导的RIG-I去甲基化对于患者的预后十分重要。而在非酒精性脂肪性肝病患者中，RIG-I分子及其甲基化水平均发生上调，与之对应，磷酸化的HMGCR水平也发生明显上调，这与上述小鼠研究中结果一致。在NASH及NASH诱导的肝癌组织中，RIG-I分子表达水平发生明显下调，STAT3磷酸化水平发生明显上调，表明在前期肝脂肪变中，RIG-I分子发生上调，进而促进胆固醇合成及脂质累积，而在NASH及NASH诱导的肝癌中明显下调，提示其可能在炎症介导的肝癌发生发挥作用。

总之，在本研究中，该团队锁定肝癌发生，聚焦RIG-I分子，在多种小鼠模型及人临床样本中，深入探究了RIG-I分子的表达、翻译后修饰及其分子功能，为临床预防肝癌发生提供了机制见解和潜在靶点。

原文链接：https://jhoonline.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13045-022-01381-6

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