师弟
师姐，为啥 CAR-T 这么难搞，一上手全都是坑！scFv 序列选不出、T 细胞分不好，这次我好不容易拿到的 T 细胞，做感染效率又很低，我都开始后悔选了这个方向。
刚开始做确实会这样，技术瓶颈出现很正常的。多学多做就好了。CAR-T 的文章光去年就发了 1,496 篇[1]，你选择方向没错的。对了，记得平时多读读文献，也能学到不少新东西。
师姐
师弟
只能加油干了，文献我也一定读，有好的论文师姐也一定发我瞅瞅
Nature Communications上的这篇文章，提到了基于人源化小鼠模型和单细胞测序发现的提升抗肿瘤活性的一个新思路，你可以精读一下，相信会对你有所帮助。
师姐
师弟
好的，下午实验结束就看！
学习之后别忘记把思路梳理到笔记上，不断积累才能有效提升～
师姐
对很多准备踏入或者已经踏入 CAR-T 细胞治疗研发的科研人来说，都有着一入 CAR-T 深似海的感慨，一步一坑，防不胜防。往往是投入了大量的时间，但是实验收获却寥寥。CAR-T 作为热门技术，每年都有大量刊文，实验进度慢还可能会导致课题撞车，研究被别的团队率先发表。
我们作为在其中摸爬滚打的过来人，对此也深有体会。为了更好的帮助大家破关 CAR-T，我们将把遇到过的问题都认真整理出来，打磨了自己的「细胞治疗笔记」，其中包括了抗体开发、CAR 分子设计和慢病毒制备、免疫细胞制备、免疫细胞表型检测、体外和体内药效评估等多个重要环节，努力帮助大家避免实验环节中的弯路坑洼。识别下方二维码，即可免费领取电子版，笔记方案一键获取！
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此外，我们也罗列出实验过程中遇到的常见问题及解决办法，供大家参考：
干货内容，先睹为快：「靶细胞的构建」常见问题解答
Q1：选定适应症和靶点，却缺乏合适的天然肿瘤细胞作为靶细胞，这种情况应该怎么选择靶细胞？
这种情况下可以选择构建相应的稳转细胞株，细胞株种类的选择上还是尽量和所研究的适应症一致，例如研究的适应症为肝癌，就可以选择相应的肝癌肿瘤细胞系来进行稳转株构建，这样构建的稳转株细胞也可以用于下游的体内抗肿瘤活性评价实验。另外，如果仅做一些简单的抗肿瘤活性评估和特异性验证工作，也可以选择 293T 和 CHO-K1 这一类比较常用的工具细胞，这类细胞易于被慢病毒感染，因此很容易获得稳转细胞，可以节省时间成本。
Q2：进行双特异性 CAR-T 的相关研究，但缺少双靶点共表达的细胞系，如何解决靶细胞的选择问题以及验证所构建的 CAR-T 细胞的特异性问题？
为解决肿瘤细胞靶点抗原表达的异质性以及 CAR-T 细胞治疗过程中存在抗原逃逸问题，双特异性 CAR-T 的研究也越来越多。在没有适合的用于双靶点 CAR-T 细胞研究的靶细胞的情况下，可以通过构建稳转细胞株来解决，用于构建稳转细胞株的细胞需尽可能来源于所研究的适应症的肿瘤细胞。为研究双特异性 CAR-T 细胞的功能，也可以构建表达单抗原以及双抗原的细胞株，这样通过体外对这些细胞株的裂解作用，可以在一定程度上评估双特异性 CAR-T 细胞的特异性。
Q3：如何解决稳转细胞株表面抗原丢失的问题？比如用 CD 20 编码慢病毒转染 293T 细胞构建了一株 293T-CD 20 稳转细胞株，但是在培养过程中发现 CD 20 的表达时高时低。
稳转细胞株如果带有真核抗性的话可以加入相应的抗生素来维持，但抗生素的加入量需要进行优化才能取得比较好的维持效果。如果不具有真核抗性，可以通过流式分选进行几轮富集，这样可能能够解决稳转细胞抗原丢失的问题。另外可以通过挑克隆的方式，筛选获得抗原稳定表达的细胞株。
Q4：做 CAR-T 细胞治疗肿瘤方面相关的研究时，如何选择合适的靶细胞来证明 CAR-T 细胞抗肿瘤效果的特异性？
可以选择靶抗原表达和不表达的细胞株，然后用 CAR-T 和对照 T 细胞分别杀伤这两种细胞，依据杀伤结果来判断 CAR-T 细胞的抗肿瘤效果是否具有特异性。
以上内容中，无论是「细胞治疗笔记」还是「靶细胞的构建」常见问题解答，相信都能对您的实验有所助益！当然不止这些！赛业生物更是基于在肿瘤免疫领域多年的研究经验，搭建出 CAR-T 细胞治疗体内体外一站式服务平台，可为科研工作者提供 scFv 序列筛选、CAR 分子设计到体外体内杀伤的全流程服务。需要了解服务详情的用户，可以点击文末「阅读原文」，或者直接联系我们：
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内容策划：邹礼平
内容审核：邱天天
题图来源：图虫创意
参考文献：
[1] Miao L, Zhang J, Zhang Z, Wang S, Tang F, Teng M, Li Y. A Bibliometric and Knowledge-Map Analysis of CAR-T Cells From 2009 to 2021. Front Immunol. 2022 Mar 18;13:840956. doi: 10.3389/fimmu.2022.840956. PMID: 35371087; PMCID: PMC8971369.
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