导读

刺五加(ASH)是一种传统草药，因其抗疲劳和抗应激作用以及补气、健脾益肾、安神而广为人知。最近的文献表明，ASH对重度抑郁症（MDD）有治疗作用，但其机制尚不清楚。目前的研究旨在探究ASH对MDD的影响和潜在的作用机制。我们基于网络药理学预测化合物潜在靶点网络。同时，慢性不可预知的轻度应激（CUMS）模型小鼠口服三种剂量（400、200和100mg/kg）的ASH，持续6周，并使用基于气相色谱-质谱（GC-MS）的肝脏代谢组学分析差异代谢物和相关代谢途径。接下来，我们应用代谢组学和网络药理学的综合分析来寻找关键靶点；最后，采用分子对接技术确定关键靶点与相应化合物的结合。代谢组学分析共发现13种代谢物和4种相关代谢途径。从网络药理学和代谢组学的结合分析，六个靶点（DAO、MAOA、MAOB、GAA、HK1和PYGM）是重叠的靶点，两个代谢途径（甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢）是最相关的途径。最后，我们验证了DAO、MAOA、MAOB、GAA、HK1和PYGM与其相应的化合物（包括异嗪皮啶、刺五加苷B1、刺五加苷C、槲皮素、山柰酚和金合欢素）的结合良好。这些结果提示ASH对MDD的潜在作用机制与调节几种兴奋性氨基酸和碳水化合物的代谢，以及DAO、MAOA、MAOB、GAA、HK1和PYGM的表达有关。

论文ID

原名：Integrated network pharmacology and hepatic metabolomics to reveal the mechanism of Acanthopanax senticosus against major depressive disorder

译名：结合网络药理学和肝脏代谢组学揭示刺五加改善重度抑郁症的作用机制

期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

IF：6.081

发表时间：2022.08

通讯作者：周明眉&孙继佳

通讯作者单位：上海中医药大学

实验结果

1. 筛选ASH的化合物和靶标

通过文献检索，我们共检索到ASH中的20种主要化合物。这些化合物的OB和DL均通过TCMSP数据库获得，结果如表1所示。我们从UniProt数据库中识别基因名称，去除无效和重复的靶点，最终得到281个靶点。

表1 ASH中活性化合物的信息

注：-表示没有关于该化合物的信息。OB，口服生物利用度；DL，药物相似性；GI，胃肠道；BBB，血脑屏障。

图1 本研究的工作方案。ASH：刺五加；FST：强迫游泳试验；MDD，重度抑郁症；OFT，旷场测试；TST，悬尾测试。

2. MDD靶点和网络识别

通过对各数据库结果的整合，我们获得了3077个MDD相关基因靶点；使用维恩图，获得了ASH和MDD的151个共享靶点（图2A）。然后我们使用与ASH相关的靶点和相应的化合物来构建网络，并使用Cytoscape将其可视化（图2B）。该网络有171个节点（20个ASH化合物和151个共享靶点）和361个边。

3.潜在生物标志物的分析

首先，如补充图S2中的行为测试结果所示，CUMS模型组小鼠在FST和TST中的不动时间显著增加，而在OFT中的总行为得分显著降低。不同剂量ASH和阳性对照氟西汀处理后，各项行为评分均有显著改善，中剂量ASH效果相对最显著。这些证实了ASH的成功抑郁模型和抗抑郁作用。

图2 (A)MDD和ASH之间的靶基因重叠。(B)药物活性成分和疾病靶点网络。紫色三角形：活性化合物；绿色菱形：靶点。更大的节点代表更大的度数。

如补充图S3A、B 所示，正常（N）组和模型（M）组小鼠肝脏的整体代谢谱仅显示出PCA评分分离的趋势。进一步进行PLS-DA评分，结果显示N组和M组代谢谱的分离趋势更加明显。

ASH高、中、低剂量组和氟西汀组的代谢模式显示在补充图S3C-F中。在PCA分析中，N组和M组呈现分离趋势，高剂量ASD（HD）组、中剂量ASD（MD）组、低剂量ASD（LD）组均接近N组，其中最明显的是MD组。阳性对照（PD）组也与M组明显分离，更接近N组。结果表明，各剂量的ASH和氟西汀均可在一定程度上恢复CUMS小鼠的肝脏代谢。

表2 ASH和氟西汀对CUMS小鼠肝脏不同代谢物的干预作用

注：倍数变化（FC）a表示M组不同代谢物相对含量相对于N组的变化倍数（FCa，值=M/N）。FCb表示给药组不同代谢物相对含量相对于M组的变化倍数（FCb值=给药组/M）。-表示未检测到该化合物。FC，倍数变化。

为了找出ASH各剂量组和M组之间的不同代谢物，我们建立了监督模式下的OPLS-DA和S-plot评分（图3）。在OPLS-DA分析中，HD组、MD组、LD组、PD组均与M组分离。置换检验的结果（补充图S4）表明所建立的模型没有过拟合。我们选取VIP值>1.0的变量进行统计分析，结合NIST 05数据库和HMDB数据库得到最终的差异代谢物。

图3每个处理组（n = 6）中CUMS小鼠肝脏代谢物组的OPLS-DA评分和S图。(A) HD组与M组(R2X = 0.655, R2Y = 0.927, Q2 = 0.568)；(B) MD组与M组(R2X = 0.759, R2Y = 0.959,和Q2 = 0.422)；(C) LD组与M组(R2X = 0.762, R2Y = 0.999，和Q2 = 0.968)；(D) PD组与M组(R2X = 0.777、R2Y = 0.978和Q2 = 0.664)。

如表2所示，HD组的8种代谢物水平有所增加。与M组相比，D-半乳糖、D-葡萄糖酸、甘氨酸、D-葡萄糖、L-天冬氨酸、L-苏氨酸水平显著升高，而2-丁烯二酸和肌醇水平显著降低。MD组的五种代谢物水平升高，包括甘氨酸、D-葡萄糖、L-天冬氨酸、L-苏氨酸和谷氨酰胺，而肌醇和L-缬氨酸的水平显著降低。PD组甘氨酸、D-葡萄糖、L-苏氨酸、谷氨酰胺水平显著升高，肌醇、L-缬氨酸水平显著降低。差异代谢物的热图如图4所示，这表明每组之间的差异代谢物。

图4各组不同代谢物热图

4. 代谢途径和相关靶点验证

模型组与各剂量ASH组之间的代谢途径见图5。根据统计分析，我们选择了p < 0.05和通路影响> 0.10的代谢途径。

图5每个处理组的代谢途径图。(A) HD组与M组；(B) MD组与M组；(C) LD组与M组；(D) PD组与M组。

模型组与HD组的差异代谢产物分别涉及甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢和淀粉、蔗糖代谢两条通路。模型组与MD组之间存在3条代谢途径，乙醛酸和二羧酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢。模型组与LD组之间的差异代谢产物仅构成一种代谢途径，即淀粉和蔗糖代谢。此外，乙醛酸和二羧酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢的两种途径对应于模型组和PD组之间的差异代谢物。参与这些代谢途径的差异代谢物如表3所示。基于这些结果，并结合KEGG数据库，MDD的关键代谢途径如图6所示。

图6代谢途径示意图。在模型组中，红色和蓝色代谢物分别代表增加和减少的水平。

基于上述结果，以下四种途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢；和淀粉和蔗糖代谢，通过KEGG数据库被选择以获得靶点。总共有130个靶点。

表3 ASH和氟西汀对CUMS小鼠肝脏代谢通路的干预作用

5. 整合分析

整合涉及四种途径的130个靶点和ASH中与化合物相关的靶点，我们确定了与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢这两种途径相关的七个共同靶点，它们是D-氨基酸氧化酶 (DAO)、单胺氧化酶A (MAOA)、单胺氧化酶 B (MAOB)、α 葡糖苷酶 (GAA)、淀粉酶 α 1A (AMY1A)、己糖激酶 1 (HK1) 和肌肉相关糖原磷酸化酶( PYGM）。Cytoscape被用于可视化ASH中的化合物网络、共享靶点、途径和相关代谢物（图 7）。此外，从网络中分析，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢与三种代谢物甘氨酸、L-丝氨酸和 L-苏氨酸相关，而D-葡萄糖和麦芽糖与淀粉和蔗糖代谢有关。每组5种代谢物的相对峰面积变化见图8。在非靶向代谢组学研究中，相对峰面积常用于表示峰所属代谢物的相对含量。它是同一样品中每种代谢物的峰面积与内标物峰面积的比值。在样品预处理过程中，每个样品都加入了已知量的内标化合物。通过与内标化合物峰面积进行对比的方法可以减少由前处理或分析仪器引起的系统误差。

图7活性化合物-重叠靶点-代谢途径潜在生物标志物相互作用网络。紫色三角形：活性化合物；绿色菱形：靶点；蓝色V：代谢途径；红圈：潜在的生物标志物。更大的节点代表更大的度数。

6.分子对接

为了进一步验证重叠目标和相关化合物的亲和力，我们将这些化合物与每种活性成分的相关靶点进行分子对接，包括异嗪皮啶与DAO、MAOA和MAOB对接；槲皮素与MAOA对接；山奈酚与MAOA对接；金合欢素与MAOA和MAOB对接；刺五加苷B1与GAA、HK1和PYGM对接；刺五加苷C与PYGM对接。

图8各组肝脏生物标志物的相对含量。(A)甘氨酸；(B) L-丝氨酸；(C) L-苏氨酸；(D) D-葡萄糖；(E)麦芽糖。*p < 0.05，与N组相比；**p < 0.01，与N组相比；#p < 0.05，与M组比较；##p < 0.01，与M组相比。

我们计算了六种化合物与相关靶标的结合能。结果列于补充表S1中。所有研究的化合物与其相关的靶蛋白具有良好的结合能（<0 kcal/mol）。结合能<0表明配体分子化合物可以自主结合受体靶蛋白。结合能较低的分子构象更稳定。

如图9A-C所示，异嗪皮啶与DAO有3个氢键和5个疏水相互作用，与MAOA有10个疏水相互作用，以及与MAOB有1个氢键和10个疏水相互作用。如图9D、E所示，刺五加苷B1与GAA有六个氢键和八个疏水相互作用，与HK1有两个氢键和七个疏水相互作用。如图9F、G所示，蛋白质PYGM与刺五加苷B1相互作用产生两个氢键和12个疏水相互作用，同时与刺五加苷C相互作用产生三个氢键和六个疏水相互作用。此外，槲皮素、山柰酚和金合欢素也与其相应的靶点有很好的结合（补充图S5）。

图9异嗪皮啶[DAO (A)、MAOA (B)和MAOB (C)]、刺五加苷B1 [GAA (D)、HK1 (E)和PYGM (F)]、和刺五加苷C [PYGM (G)]的分子对接图。

在代谢组学分析中，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢；淀粉和蔗糖代谢是ASH改善MDD的最重要途径，130个靶点共涉及四种代谢途径，包括DAO、MAOA、MAOB、GAA、HK1和PYGM。网络药理学分析表明，ASH靶点与MDD靶点的交叉点为151，其中还包括DAO、MAOA、MAOB、GAA、HK1和PYGM。因此，我们将代谢组学和网络药理学结合在一起，DAO、MAOA、MAOB、GAA、HK1和PYGM是两个结果中的共同靶标。最后，分子对接表明，所有这些靶标都可以与其相应的化合物稳定对接，包括异嗪皮啶、刺五加苷B1、刺五加苷C、槲皮素、山奈酚和金合欢素。综上所述，ASH通过甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢这两个途径影响MDD的病理表现，并靶向DAO、MAOA、MAOB、GAA、HK1和PYGM。

从代谢组学的结果中获得的显著途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，在精神障碍中很常见。与我们的结果相似，抑郁症患者的甘氨酸水平下降。甘氨酸和丝氨酸是神经递质。甘氨酸被证明具有抗动脉粥样硬化的作用，MDD患者的低甘氨酸水平可能意味着MDD患者有动脉粥样硬化的风险。苏氨酸是神经系统不可缺少的氨基酸。它可以转化为甘氨酸并通过血脑屏障转移。神经系统中苏氨酸过多会影响神经递质的平衡。丝氨酸是一种非必需氨基酸，它被主动转运到大脑，然后转化为甘氨酸和磷脂酰胆碱，两者都与记忆功能有关。丝氨酸和甘氨酸都调节N-甲基-天冬氨酸(NMDA)受体，该受体在大脑中的谷氨酸途径中起主要作用。大脑中的DA和谷氨酸系统高度相关。

网络药理学结果显示，靶点DAO、MAOA、MAOB参与甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢。DAO、MAOA、MAOB广泛分布于肝脏和肾脏，DAO主要分布于肠道。DAO是一种过氧化物酶体黄素蛋白，可直接影响丝氨酸水平。研究发现，过度表达DAO会加剧精神分裂症。丝氨酸在前脑中含量丰富，可作为NMDA受体的共激动剂来增强神经传递。同时，DAO可以分解丝氨酸，从而调节神经传递。异嗪皮啶与DAO有很好的对接，提示异嗪皮啶可能通过调节DAO来缓解抑郁症状。

单胺氧化酶(MAO)有两种亚型：MAOA和MAOB，它们被认为介导大脑中单胺神经递质（包括DA）的降解。Cho等人发现MAOA可以调节DA水平，而MAOB可以调控tonic GABA水平。此外，MAO活性升高是导致抑郁症等神经疾病中单胺神经递质失活的原因。MAO抑制剂是最早发现的抗抑郁药之一，通过抑制MAO来减少中枢单胺类神经递质（如5-HT和DA）的降解，并改善患者情绪。在我们的分子对接结果中，异嗪皮啶、槲皮素、金合欢素和山柰酚均与MAOA和MAOB结合良好，表明这些化合物的抗抑郁作用机制与MAO抑制剂相似。此外，与我们的结果相似，He等人从ASH的根提取物中发现异嗪皮啶具有潜在的MAOB配体抑制活性。同时，研究表明，一些黄酮类化合物（包括槲皮素、金合欢素和山柰酚）对MAOA或MAOB有抑制活性。

淀粉和蔗糖代谢是我们研究结果中的另一个主要途径，它是MDD患者的主要途径。它属于碳水化合物代谢，我们研究中涉及的主要不同代谢物是D-葡萄糖和麦芽糖。麦芽糖是由糖苷键连接的两个葡萄糖单元组成的二糖。葡萄糖是主要的能量来源，在我们的结果中，模型组的D-葡萄糖降低，提示能量代谢紊乱。此外，能量缺乏会导致最常见的抑郁症状，包括活动减少、身体疲劳和认知功能减慢。抑郁症患者的异常葡萄糖代谢已被证明与自杀风险有关，这可能与细胞因子介导的炎症过程有关。葡萄糖代谢稳态是维持正常大脑功能的基础，在MDD患者中，大脑许多区域的葡萄糖代谢降低。在抑郁症或肥胖症的抑郁症模型中，脑细胞对葡萄糖的吸收增强，或者换句话说，其代谢较慢。同时，葡萄糖是神经元和胶质细胞的主要能量底物，对神经元微环境非常重要。

GAA，酸性α-葡萄糖苷酶，广泛分布于全身循环，缺乏时会导致许多组织和整个中枢神经系统中的糖原积累和严重的神经肌肉损伤，最终导致庞贝氏病（一种代谢和神经肌肉疾病）。肝脏中GAA表达增加可以改善肌肉和中枢神经系统中的糖原积累。在大脑中，糖原是重要的能量储备，糖原水平的降低与星形胶质细胞的代谢和功能直接相关。特别是，神经元的主要能量底物来源是葡萄糖，它进入星形胶质细胞并产生储存的糖原。当星形胶质细胞不能及时向大脑提供糖原时，神经元就会萎缩死亡。如果中枢神经系统中的糖原含量降低，神经递质和动作电位会立即受到严重影响。研究表明，低水平的海马糖原可能是诱发小鼠抑郁样行为的机制之一。

HK1主要分布在大脑中，是一种己糖激酶，通过葡萄糖的磷酸化启动糖酵解的第一步。附着在线粒体外膜（OMM）上的HK1是脑能量代谢的关键特征之一，还能防止细胞凋亡和氧化损伤，从而确保神经元和其他细胞的存活。一项研究发现，抑郁症患者死后顶叶皮层脑组织中，与健康对照组相比，HK1对OMM和精神分裂症的附着减少。此外，HK1线粒体附着也与神经生长和大脑发育有关。涉及情绪和认知功能的神经元存活和生长对于抑郁症的治疗至关重要。此外，怀孕期间的一系列感染或仅仅是炎症可能会增加孩子患自闭症和抑郁症的风险。

PYGM是一种肌糖原磷酸化酶或肌磷酸化酶，主要参与糖原分解并为细胞生物过程提供足够的能量。PYGM在人体骨骼肌中高度表达，但也存在于其他组织和器官中，例如大脑的不同部位、肝脏、淋巴组织（扁桃体）、血液（粒细胞）、唾液腺和脂肪组织。肝脏中缺乏PYGM会导致Hers病（一种糖原储存病）。研究发现，在精神分裂症的星形胶质细胞中，参与星形胶质细胞代谢的PYGM和RAC1（一种调节PYGM活性的激酶）水平降低，导致背外侧前额叶皮层短暂的局部能量不足。在背外侧前额叶皮层，谷氨酸介导的神经传递障碍和能量代谢的变化在精神分裂症中很常见。RAC1通过激活PYGM促进糖原分解并为神经元提供即时能量。此外，这种能量来源对于谷氨酸能神经传递和葡萄糖利用过程至关重要。近年来，谷氨酸介导的神经传递障碍假说在抑郁症研究中逐渐流行起来。绝大多数脑神经元和突触是谷氨酸能的，谷氨酸突触传递主要介导认知和情感。我们在MDD患者的内侧额叶皮质中观察到谷氨酸能代谢物水平降低。因此，对于神经精神疾病的治疗，糖原分解的调节可能是至关重要的。

分子对接结果表明，刺五加苷B1与GAA、HK1和PYGM结合良好，而刺五加苷C与PYGM有良好的对接。因此，我们提出GAA和PYGM可能通过调节脑内糖原代谢来影响抑郁症的发生和发展，而HK1通过调节糖酵解影响神经元的存活和生长，最终影响抑郁症患者的情绪。此外，结果还提示刺五加苷B1和刺五加苷C通过调节能量代谢发挥抗抑郁作用。

我们的研究为ASH治疗抑郁症的机制和物质基础提供了线索，但目前的研究仍存在一定的局限性。首先，本研究基于肝脏代谢组学研究。虽然肝脏代谢物也可能进入血液循环并与靶标或药物活性成分相互作用，它们仍然需要与血液循环和大脑中的成分进行比较。其次，ASH只有部分活性成分可以被直接吸收并通过血脑屏障。尽管它们在网络药理靶点的预测中与许多抑郁症靶点密切相关，但它们在体内的实际结合位点仍不清楚。此外，根据目前的结果，我们推测肝脏可能在ASH的抗抑郁作用中起重要作用，且靶点可能不限于中枢神经系统。最后，目前的研究结果仍是初步的，进一步的验证正在设计中，例如ASH的单一成分对抑郁症的影响以及预测靶点分布和表达的变化，以及需要靶向的定量实验来验证这些靶点在ASH调节MDD中的作用。

结论

在我们的研究中，首先，ASH给药改善了CUMS小鼠的抑郁样行为，同时改善了肝脏代谢组学的改变。其次，结合网络药理学和分子对接技术，我们预测了ASH治疗抑郁症的潜在活性成分、靶点及相关代谢途径，也就是说，异嗪皮啶、槲皮素、山柰酚和金合欢素可能靶向DAO、MAOA和MAOB来调节甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，而刺五加苷B1和刺五加苷C似乎通过靶向GAA、HK1和PYGM来调节淀粉和蔗糖代谢。由于ASH中的成分及其靶点主要来自文献和网络药理学而不是直接实验，因此这些结论具有预测性，需要通过对单个靶点的化合物进行定性和定量实验来验证。此外，抑郁症模型小鼠的代谢途径结果与临床患者存在一定差距，因此需要基于临床样本中代谢物定量分析的验证研究。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35990602/

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