精氨酸（L-精氨酸）是组成生命体中蛋白质的二十种氨基酸之一，其生物功能包括刺激生长激素的分泌，改善内源性一氧化氮的代谢和促进伤口愈合，因此被用作药品和膳食补充剂，广泛应用于医疗、食品和化妆品等领域。
近年来，受主要国家人口老龄化的推动，以及在全球化妆品和个人护理行业的广泛应用，L-精氨酸在全球的销售量更是获得巨大增长。
根据 SkyQuest 的数据，2021 年 L-精氨酸的全球市场规模为 1.3519 亿美元，预计到 2028 年将达到 1.5928 亿美元，在预测期内（2022-2028 年）将以超过 2.37% 的复合年增长率增长。
为了满足当前和未来的市场需求，同时结合可持续发展的生产理念，通过定制微生物细胞工厂发酵生产 L-精氨酸逐渐成为一种主流方式，其实现高效、稳定生产的关键在于高效率的工程菌株。
精氨酸的合成途径长、前体物多、能量和还原力需求多、合成难度很大，在相应的工程菌株的挖掘上，面临“细胞内相互作用网络复杂”和“对全局代谢调控了解不足”的问题，这也是近些年来鲜有高效率菌株报道的根本原因。
近日，天津科技大学的谢希贤等人在Metabolic Engineering上报告，结合代谢工程与生物传感器辅助诱变筛选，开发出了极具生产潜力的工程大肠杆菌。相关文章题为“Metabolic reprogramming and biosensor-assisted mutagenesis screening for high-level production of L-arginine in Escherichia coli”。谢希贤为文章共同作者之一。
（来源：Metabolic Engineering）
“这项工作具有重要意义，一方面，开发高效稳定的精氨酸细胞工厂是满足目前以及未来市场需求量的关键；另一方面，精氨酸合成菌株代谢流调控的研究将为构建高效谷氨酸族衍生物（如瓜氨酸、鸟氨酸）细胞工厂，以及其它复杂代谢产物的合成研究提供理论参考和实践经验。”谢希贤说道。
谢希贤于 2007 年博士毕业于厦门大学生命科学学院，并入职天津科技大学生物工程学院，从事氨基酸类产品的代谢工程研究；2012 年 3 月曾赴美国 Rice University 访学，为期一年。
▲图丨谢希贤（来源：受访者提供）
目前他的主要研究方向为：1）合成生物学与代谢工程：微生物合成代谢网络重构与优化、高附加值氨基酸和核苷酸及衍生物代谢工程育种与产品开发；2）系统生物学：重要工业微生物生理代谢、基因组和蛋白质组等比较组学研究。
结合代谢工程与诱变筛选手段，生产强度为迄今最高值
微生物自身的代谢流量在不同代谢途径中的分配并非一成不变，通过对代谢途径的动态平衡与重构，可以实现目标产物的高效生产。
谢希贤等人在强化精氨酸合成支路途径的基础上，动态调整代谢流在中心代谢途径和精氨酸合成支路途径的分配。
“这也是这项研究的一大难点”，谢希贤说道，“我们需要最大限度地提高α-酮戊二酸节点通向精氨酸合成支路的通量，同时保持细胞生长和精氨酸生产之间的平衡。”
针对该问题，谢希贤等人利用生长偶联型启动子对 TCA 的关键基因进行动态转录调控，也就是设计了一个切换开关，通过响应不同时期细胞生理状态来动态调整代谢流，将其更多地从 TCA 循环拉向 L-精氨酸生物合成。
在这一过程中，对于“精氨酸合成途径关键酶”的选择和“强化基因表达”的选择同样非常重要。
产物合成途径的关键酶往往受终端产物的反馈调控机制影响。“筛选不受反馈调控机制影响的关键酶基因（如：异源基因、突变基因）是强化产物合成限速步骤的关键。”
在多个基因的强化表达方面，谢希贤等人选择基于 CRISPR-Cas9 的高效基因编辑技术，在大肠杆菌染色体上过表达靶基因。“相比于使用质粒载体过表达基因的策略，基因组整合可以避免靶基因表达不稳定以及抗生素的使用，减少细胞代谢负担，更利于推进工程菌株的工业化应用。”
▲图丨精氨酸菌株代谢改造策略汇总（来源：受访者提供）
接下来还需要进行精氨酸高产靶点的挖掘，这也是研究中的第二大难点。
“想要进一步开发细胞生产潜能，需要从复杂且紧密关联的细胞代谢网络中挖掘促进精氨酸合成的潜在有益靶点，这无疑是很大的工作量。”
于是，谢希贤等人设计了一个生物传感器辅助的高通量筛选平台，利用该平台从突变文库中快速筛选出高产精氨酸突变株，并采用多组学分析技术，挖掘突变菌株高产机理，进一步开发 L-精氨酸的生产潜力。
最终，最好的 ARG28 菌株在 5 L 生物反应器中生产了 132 g/L 的 L-精氨酸，糖酸转化率为 0.51 g/g 葡萄糖，生产强度为 2.75 g/(L·h)，这是迄今为止报道的最高值。
各项技术指标为目前市场最佳，工业生产潜力大
谢希贤告诉生辉 SynBio，想要开发一个更具有竞争力和更经济的 L-精氨酸生物工艺，高效稳定的精氨酸细胞工厂是基础。
“我们开发的精氨酸高产菌株在发酵罐中的精氨酸产率、糖酸转化率、生产强度等指标都超过了目前市场上最好的技术指标，有望降低生产成本。因此，以该工程菌株为基础开发清洁高效的精氨酸生产工艺，将比现有的生产工艺更具竞争力和经济性。”
他继续说道，“从实验室发酵数据来看，该菌株具有较好的商业转化潜力。但考虑到从实验室水平放大到工业水平的众多干扰因素的影响，该菌株进入稳定的工业化应用还需要加大过程化研究。”
（来源：受访者提供）
谢希贤还透露，这项研究接下来将主要集中在两个方面：其一，利用高通量筛选平台继续筛选高产精氨酸突变菌株，并挖掘突变菌株中潜在的高产靶点；其二，利用多组学技术分析有益靶基因促进精氨酸高效合成的潜在机理。
而除了精氨酸外，谢希贤团队还在多种高值氨基酸的生产方面取得了突破，包括组氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸等。
另外，“我们针对嘧啶核苷，如尿苷、尿嘧啶、胞苷、胞嘧啶、胸苷等；以及一些高附加值的氨基酸衍生物或活性物质，如依克多因、麦角硫因、茶氨酸、高丝氨酸、5-羟色氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、唾液酸等，也都构建了高效的工程菌，优化了生物合成工艺，部分产品已经在企业进行工业生产。”
写在最后
采访最后，谢希贤还分享了在“发酵过程优化放大、产品分离提取”这一方面的心得。
他表示，发酵过程优化放大和产品分离提取是产品生物合成的中下游阶段，也是决定是否产业化的关键阶段。
“细胞合成代谢网络是细胞的“内因”，这个“内因”需要匹配合适的环境条件“外因”。不同菌株的工艺差异很大，不同遗传表型的同一菌株的培养工艺可能也相差很大。所以过程化研究，除了需要工程师大量的现场发酵等摸索实验，和上游育种人员的密切合作也很重要。”
“批次的发酵过程研究需要尽可能采集多样化的数据，包括细胞生物量、原料消耗量、产物生成量、尾气组分等，必要时还需要分析胞内的关键代谢物浓度变化、代谢流变化，从而更全面的解析细胞在不同阶段的代谢情况，优化出效率更高的发酵工艺。”
“高效的发酵工艺有助于获得高产率的主产物，低含量的副产物，质量更好的发酵液，也会极大减轻产品提取工艺阶段的难度，提高提取收率和产品质量。”
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