2区-if5+湖南中医药大学:黄精多糖调节微生物-肠-脑轴改善衰老小鼠的认知功能|代谢物|多糖|微生物|活性|肠道细菌|脑轴|血清|衰老小鼠|黄精

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导读

抗衰老已引起全世界的关注。黄精多糖（PSP）作为黄精的主要成分，可通过调节肠道微生物和相关代谢产物，显示出良好的抗衰老活性。同时，本研究观察到拟杆菌门的丰度增加，厚壁菌门、Patescibacteria、放线菌门和弯曲杆菌的丰度减少。此外，代谢组学分析表明，PSP与12种显著不同的代谢产物的丰度有关，主要富集于嘌呤代谢、牛磺酸和亚牛磺酸、甘油磷脂、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢和核黄素代谢。我们的结果表明，PSP可以改善衰老小鼠的认知功能，并通过“微生物群-肠道-大脑”轴调节氧化应激。

亮点：

1. PSP可通过微生物-肠-脑轴改善衰老小鼠的认知功能；

2. 拟杆菌门和厚壁菌门与认知功能显著相关；

3. 拟杆菌门和厚壁菌门与氧化应激显著相关；

4. 认知障碍的嘌呤代谢值得深入研究。

论文ID

原名：Polygonatum sibiricum polysaccharides improve cognitive function in D-galactose-induced aging mice by regulating the microbiota-gut-brain axis

译名：黄精多糖通过调节微生物-肠-脑轴改善D-半乳糖诱导衰老小鼠的认知功能

期刊：Journal of Functional Foods

IF：5.223

发表时间：2023.03

通讯作者：秦裕辉，肖德华，张水寒

通讯作者单位：湖南中医药大学

实验设计

实验结果

1. 体重和明显变化

我们从建模开始，每周记录体重。如表1和补充图S1所示，各组之间没有显著差异，随着建模时间的增加，小鼠体重逐渐增加。其中，D-gal组的小鼠体重增加缓慢，并伴有一般行为状态，如精神萎缩、行动迟缓、毛发粗糙和活动减少。其他组的小鼠体重显著增加，尤其是正常对照（NC）组和多奈哌齐（Donepezil）组。

图1 PSP干预研究的实验设计

2. PSP改善D-半乳糖诱导衰老小鼠的认知功能

为了确定PSP对D-半乳糖诱导的衰老小鼠的空间记忆的影响，我们进行了Morris水迷宫（MWM）测试。测试当天，我们用Smart v3.0小动物行为记录和分析系统（Reward Corporation）监测各组小鼠的游泳路径。图2A–F分别为NC、D-gal、PSP150-600和Donepezil组小鼠的路径，与NC组相比，模型组穿过隐藏平台的次数减少，PSP300和PSP600组的路径比D-gal组的更紧密，穿过隐藏平台次数增加。我们在Donepezil组也观察到类似的追踪路径模式。此外，我们发现与NC组相比，模型小鼠的目标区距离（%）（28.88±0.92 s，p<0.001）和目标区快速通过时间（秒）（23.13±0.90 cm，p<0.001）显著增加，第一次进入区域到目标区域的潜伏期（秒）（7.83±1.76cm，p＞0.05）降低，目标区域的平均速度（18.14±0.90cm，p＜0.05）显著降低，表明模型小鼠的空间学习和记忆能力受损（图2，G–J）。此外，PSP150组第一次进入区域到目标的潜伏期（秒）显著增加（p<0.05）。同时，PSP300的目标区距离（%）（p<0.001）和目标区快速通过时间（秒）（p<0.05）显著增加。PSP600和Donepezil处理组的目标区域距离（%）（PSP600：p<0.0001；Donepezil:p<0.001）和目标区域快速通过时间（秒）（PSP1000：p＜0.01；Donepizil:p<0.01）均缩短，而第一次进入区域到目标区的潜伏期（秒）（PSP600：p<0.05；Donepezil：p<0.05）和目标区域的平均速度（PSP6600：p<05；Donepizil：p<0.05）均增加。这些结果表明，PSP对空间记忆的影响是剂量依赖性的，类似于Donepezil的作用。

表1建模期间体重的变化。（与D-gal组相比，*p<0.05，**p<0.01）

图2 PSP对空间学习和记忆能力的影响

（A–F）分别为NC、D-gal、PSP150、PSP300、PSP600和Donepezil组的MWM代表性图片。（G）目标区域内的距离（%）。（H）第一次进入区域到目标区域的潜伏期（秒）。（I）目标区域内的快速通过时间（秒）。（J）目标区平均速度。（与NC组相比，#p<0.05，##p<0.001；与D-gal组相比，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.0001，n=6）。

3. PSP改善D-半乳糖诱导衰老小鼠脑组织的病理变化并减少氧化应激损伤

海马CA1和CA3的苏木精-伊红染色图像分别如图3A和B所示。CA1和CA3的Nissin染色图像如图3C和D所示。海马CA1区和CA3区神经元排列密集，数量众多，形态完整，核圆形大，无坏死。D-gal组海马CA1、CA3区神经元排列稀疏不规则，数量减少，有明显的固缩、神经元暗染、轴突空泡变性等形态改变。这与之前的研究一致。大脑的生化评估结果如图3E–G所示，血清结果的生化评估如图3H–J所示。D-gal组小鼠海马丙二醛（MDA）含量（P<0.01，n=4）和血清MDA含量（P<0.0001，n=4）显著升高。SOD（n=4，海马：P<0.01；血清：P<0.01）和GSH-Px（n=4；海马：P<0.01，血清：P<0.001）活性显著降低。这些结果表明，模型组小鼠的大脑存在神经和氧化损伤。

在组织病理学评估中，PSP150-600和Donepezil组的CA1和CA3区域的神经元排列比D-gal组更紧密，形态完整，核仁清晰，受损神经元比例降低。在生化评估中，MDA含量（海马：PSP300和PSP600组P<0.05，Donepezil组P<0.001；血清：PSP150组P<0.05，PSP300组P<0.01，PSP600、Donepezel组P<0.001）增加，超氧化物歧化酶（SOD）（海马：PSP300组P<0.05；血清：PSP3000组P<0.05，PSP600和Donepezil组P<0.01）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）（海马：PSP300组P＜0.01，PSP600组P＜0.001，Donepezel组P＜0.05；血清：PSP150组P＜05，PSP3000组P＞0.01，PSX600和Donepezel组P＜001）活性降低，表明PSP具有神经保护和抗氧化作用。

图3 PSP对神经保护和抗氧化的影响

每组海马CA1（A）和CA3（B）切片（400×）的H&E染色的代表性图像。每组海马CA1（C）和CA3（D）切片（400×）的Nissl染色的代表性图像。（E-G）脑中的MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性。（H-J）血清MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性。（与NC组相比，#p＜0.01，##p＜0.001，###p＜0.0001；与D-gal组相比，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，n=4）。

4. PSP对D-半乳糖诱导衰老小鼠肠道微生物群的影响

衰老与胃功能紊乱和神经系统退行性改变有关，并可能影响肠道微生物群的组成和功能。研究表明，肠道微生物群的组成会影响衰老速度。因此，我们使用16S rDNA测序技术分析粪便样本，以确认肠道菌群的变化。从行为数据和氧化应激指标来看，PSP600的效果优于PSP150和PSP300。因此，我们选择PSP600作为代表性药物干预组，对NC、D-gal和PSP600的肠道细菌进行了分析，这将进一步解释PSP衰老表型的相关变化和药效作用，并进一步探讨PSP可能的抗衰老机制。

为了验证PSP对肠道细菌的影响，我们对NC组、D-gal组和PSP给药组小鼠粪便样本的V3-V4区域进行了16S rRNA基因测序，以观察肠道微生物的变化；我们使用ace、Chao1、Shannon和Simpson指数分析肠道微生物群的α多样性。结果显示各组小鼠的微生物种类存在显著差异（图4A–D）。与NC组相比，衰老小鼠肠道微生物群的多样性降低，但PSP处理后多样性增加。基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）显示NC组和D-gal组之间的微生物组成和结构存在显著差异。PSP组与NC组的趋势相似，表明PSP对衰老小鼠的肠道微生物群具有显著的调节作用，如图4E所示。

为了进一步了解PSP对肠道微生物群的影响，我们分析了三组小鼠在门和属水平上的肠道微生物群相对丰度。在门水平，拟杆菌门、厚壁菌门、Patescbacteria、放线菌门和弯曲杆菌的优势菌群构成了正常小鼠的主要种群。我们在其他组中观察到相同的组成。从图4F可以直观地看出，D-半乳糖诱导的衰老小鼠肠道细菌的组成发生了显著变化。此外，与老化密切相关的B/F也发生了显著变化。NC组的B/F比为1.51，老龄小鼠的B/F比值降至0.82，PSP处理后恢复至1.34。在属水平上（图4G），每组小鼠的肠道菌群由norank_f__Muribaculaceae、乳杆菌、Dubosiella、Candidatus_Ssacharimonas、norank_f__norank_o__Clostrida_UGG-014、毛螺菌等组成。在D-半乳糖诱导的衰老小鼠的肠道细菌中，norank_f__Muribaculaceae、norank_f__norank_o__Clostrida_UGG-014和毛螺菌的比例下降。PSP处理后，乳杆菌和Candidatus的比例降低，norank_f__Muribaculaceae、norank_f__norank_o__Clostrida_UGG-014和毛螺菌的比例增加。

图4 PSP对D-半乳糖所致衰老小鼠肠道微生物群的影响

（A）ace指数。（B）Chao指数。（C）Shannon指数。（D）Simpson指数。（E）PCoA分析。（F）门水平肠道微生物群的相对丰度。（G）肠道微生物群在属水平上的相对丰度。

5. 15个逆转的操作分类单元与衰老密切相关

在OTU水平上，肠道微生物组存在显著差异。物种的veen图谱分析显示，正常小鼠中有544个OTUs，D-半乳糖诱导的衰老小鼠中有505个OTUs。PSP处理后，OTU数量增至529个。其中，三组小鼠共同有429个OTUs，如图9A所示。然后，我们使用Kruskal-Wallis H秩和检验筛选了具有显著差异的前15个OTUs（图9B），其中大部分集中在拟杆菌属（OTU280、OTU389、OTU392、OTU460、OTU464、OTU475、OTU478、OTU486和OTU554）、厚壁菌门（OTU244、OTU388和OTU427）和放线菌门（OTU447、OTU474和OTU575）。

6. PSP对D-半乳糖诱导衰老小鼠粪便、血清和皮层代谢特征的影响

为了检测与衰老相关的代谢产物和与PSP治疗衰老疾病有关的代谢产物，OPLS-DA用于区分粪便、血清和脑组织代谢谱的总体差异。如图5A–C所示，NC、D-gal和PSP组之间的代谢谱显示出明显的差异。此外，结果表明，OPLS-DA模型在粪便(R2Y (cum) = 0.998, Q2 (cum) = 0.447)、血清(R2Y (cum) = 0.993, Q2 (cum) = 0.538)和大脑(R2Y (cum) = 0.994, Q2 (cum) = 0.233)中较为稳定，具有较好的预测能力。根据P＜0.05和VIP＞1的标准筛选NC和D-gal之间的差异代谢产物，粪便中获得382种代谢物，血清中获得57种代谢物，脑组织中获得336种代谢物作为差异代谢物。然而，我们在粪便、血清和大脑中没有发现共同的差异代谢物。因此，我们分析了所有代谢产物都参与的富集度最高的前三种代谢途径。我们发现D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢和亚油酸代谢得到了富集（图5D）。

在上述区分NC和D-gal的所有差异代谢产物中，与D-gal和PSP组相同的代谢产物被称为关键代谢产物。在PSP组中，粪便中有35种关键代谢产物，其中10种表达上调，25种表达下调（图6C，D；表2）；血清中有9种关键代谢产物，其中8种表达上调，1种表达下调（图7B，C；补充表S1）；我们在皮层中发现了58种关键代谢产物，其中33种表达上调，25种表达下调（图8C，D；补充表S2）。所有关键代谢产物都参与的前三种代谢途径是嘌呤代谢、核黄素代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（图5E）。

这些结果表明PSP延缓衰老的代谢作用可能是组织特异性的。与D-半乳糖处理的衰老小鼠代谢谱相比，PSP处理的小鼠代谢特征被部分逆转，有向正常小鼠恢复的趋势。此外，不同代谢产物所涉及的所有代谢途径中的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，值得进一步关注。

图5 PSP对衰老小鼠粪便、血清和皮质代谢的影响

（A）粪便中的OPLS-DA。（B）血清中OPLS-DA。（C）皮质中的OPLS-DA。（D）NC和D-gal组粪便、血清和皮质中所有代谢产物的途径分析。（E）D-半乳糖和PSP组粪便、血清和皮质中所有关键代谢产物的途径分析。

7. 粪便、血清和皮层中关键差异代谢物的代谢途径

我们使用KEGG数据库进行差异代谢物的途径分析。在粪便中，关键代谢产物的代谢途径分析和富集分析如图6A和B所示。我们使用Violin图表示前两种代谢途径中涉及的关键代谢产物表达：牛磺酸和亚牛磺酸代谢（一种代谢产物）和嘌呤代谢（两种代谢产物）（图6E）。L-半胱氨酸亚磺酸参与牛磺酸和亚牛磺酸代谢，尿囊酸和黄嘌呤核苷参与嘌呤代谢。

血清中的关键代谢产物集中在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（一种代谢产物）和甘油磷脂代谢（一个代谢产物）中（图7A）。图7D显示了相关关键差异代谢物的Violin图。D-天冬氨酸参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。LysoPC（14:1（9Z））参与甘油磷脂代谢。

表2粪便中的差异代谢物(↑表示增加；↓表示减少。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p<0.001）

皮层中的关键代谢产物集中在嘌呤代谢（六种代谢产物）和核黄素代谢（一种代谢产物（图8A，B）。我们使用KEGG平台进行富集代谢途径分析和富集代谢产物集，如图8E所示。腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、鸟苷3′、5′-环磷酸、次黄嘌呤和GMP参与嘌呤代谢，核黄素参与核黄素代谢。

图6粪便中关键差异代谢产物的代谢途径

（A）通路分析。（B）通路富集分析。（C）NC和D-gal组中差异关键代谢产物的丰度。（D）D-半乳糖和PSP组中不同关键代谢产物的丰度。（E）前两个代谢途径中涉及的关键代谢产物的Violin图。

图7血清中关键差异代谢产物的代谢途径

（A）通路分析。（B）NC和D-gal组中差异关键代谢产物的丰度。（C）D-半乳糖和PSP组中不同关键代谢产物的丰度。（D）前两个代谢途径中涉及的关键代谢产物的Violin图。

8. 肠道细菌和差异代谢产物与氧化应激的关系

我们对具有显著差异的OTUs和102种关键差异代谢物（粪便中35种，血清中9种，皮质中58种）进行了相关性分析，以分析差异肠道细菌和差异代谢物之间的关系。然而，并非所有显著的关键代谢产物都与不同的肠道微生物强相关或弱相关。我们使用Mantel检验来探索这些关联，以评估不同OTU的丰度与组织中的总体关键代谢产物之间的相关性（图9C）。值得注意的是，拟杆菌属（OTU460）与粪便、血清和皮质的代谢产物密切相关，拟杆菌科（OTU392、OTU464）仅与皮质的代谢相关，厚壁菌门（OTU244）仅与粪便的代谢相关。这些结果表明，代谢产物，特别是在皮层中的，与肠道细菌密切相关。然后，我们应用相关热图来分析OTU和代谢途径中涉及的12种显著差异关键代谢产物。结果（图9D）表明，OTU460和OTU475与所有12种差异关键代谢产物显著相关；OTU478和OTU388与11种和10种代谢产物显著相关。关于其他OTUs，OTU389、OTU486、OTU392、OTU274、OTU280、OTU464和OTU554分别与8、7、6、4、4、3、1和1种代谢产物显著相关。与粪便和血清相比，皮质中的代谢产物与肠道细菌的相关性更强，这与Mantel分析的结果一致。

图8皮层关键差异代谢产物的代谢途径

此外，我们在脑组织中进行了OTU和氧化应激指标之间的相关热图，我们发现MDA与OTU554呈正相关，与OTU475、OTU460、OTU478、OTU388、OTU280和OTU486呈负相关。SOD与OTU475、OTU460、OTU478、OTU389、OTU388、OTU280呈正相关。GSH-Px与OTU486和OTU427呈正相关，与OTU554呈负相关。这些结果揭示了PSP调节的微生物种类与氧化应激之间的相互作用。

图9肠道细菌与差异代谢产物之间的关系

（A）物种Veen图分析。（B）Kruskal-Wallis H检验。（C分析）Mantel检验不同OTU丰度与粪便、血清和皮质差异成分的整体差异代谢状态之间相关性。（D）差异OTU与差异富集代谢物的相关性。（E）脑组织中不同OTU与氧化应激指标的相关性。

衰老是人类的一个主要问题，尤其是大脑老化。人口老龄化带来的老年人健康问题日益突出。在我们的研究中，我们从“微生物群-肠道-大脑”轴的角度研究了PSP对D-半乳糖诱导的衰老小鼠的抗衰老作用（图10）。此外，我们证明PSP可以减少D-半乳糖诱导的衰老小鼠大脑的氧化应激损伤，并有效改善学习和记忆。

图10衰老过程中主要代谢产物在“微生物-肠道-大脑”轴中富集的代谢概述

初步证据表明，肠道失调可能引发先天免疫反应和轻度慢性炎症，从而导致与年龄相关的退化、认知障碍和衰老。此外，研究表明，随着年龄的增长，老年人肠道微生物群的多样性降低，并伴随着双歧杆菌的减少以及厚壁菌和变形杆菌的增加。在我们的研究中，我们发现D-半乳糖诱导的衰老小鼠肠道微环境的紊乱主要是厚壁菌门（3/15）、拟杆菌门（9/15）和放线菌门（3/15）。厚壁菌是正常小鼠体内最丰富的肠道微生物，与衰老密切相关。此外，厚壁菌门与拟杆菌门（F/B）的比率随着年龄的增长而增加，这是衰老过程中认知障碍和氧化应激的重要原因。PSP处理小鼠的组成也有类似的趋势，这表明PSP可以通过改变D-半乳糖诱导衰老小鼠的肠道微生物群组成来影响氧化应激并改善学习和记忆能力。

此外，有证据表明，微生物组极大地影响动物体液和组织代谢组，许多与疾病相关的代谢产物被视为“微生物共代谢产物”。最近的研究表明，与肠道微生物群密切相关的代谢变化可以引发各种疾病。基于HPLC-QE-MS/MS代谢组学平台，我们系统分析了PSP给药后老年小鼠粪便、血清和皮层中的内源性代谢产物。我们确定了12种关键的差异代谢物作为潜在的PSP代谢标志物。随后的Mantel试验的结果表明，具有显著差异的OTUs与肠-脑轴上的每一种差异代谢物完全或部分相互作用，提示肠道微生物群或其代谢产物在肠-脑相互作用过程中发挥不同的作用。然而，代谢反应对肠脑轴上的不同组织（包括粪便、血清和皮层）是特定的，而皮层具有最关键的不同代谢产物。这一结果表明，衰老小鼠的脑组织与肠道细菌最相关，这与之前的研究结果一致。

通过相关分析，我们发现OTU460（拟杆菌，norank_f__Muribaculaceae）、OTU475（拟杆菌，Prevotellacee_NK3B31_group）和OTU478（拟杆菌，Prevotelacee_UCG-001）与氧化应激指标显著相关，这与先前的研究结果一致。研究证明，Lachnospiraceae_UCG-001是阿尔茨海默病认知障碍形成的关键肠道细菌。此外，Shao等人证实，norank_f__Muribaculaceae可以通过菌群-肠-脑轴调节氧化应激，从而影响溃疡性结肠炎的发生。Gao证明它对老年痴呆症的认知功能有一定的调节作用。研究者们已证明Prevotellacee_NK3B31_group与嘌呤代谢密切相关，可影响认知功能。

因此，我们认为这三种肠道细菌与认知功能密切相关。此外，肠道菌群和代谢产物之间的相关性表明，肠道微生物群的稳态影响代谢产物并导致认知障碍，提示存在调节衰老的微生物群-肠道-脑轴。最相关的代谢产物是富含嘌呤代谢的关键差异代谢产物。如上所述，嘌呤代谢与认知功能密切相关。该通路中的代谢产物也与氧化应激和认知障碍显著相关。腺嘌呤是形成几个重要中间体的核碱，如ATP和NADP。它主要以腺嘌呤核苷酸的形式存在于体内，它经常与烟酸一起合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，烟酸是人体衰老的重要因素。同样，鸟嘌呤也是核酸（DNA和RNA）的基本成分之一。研究发现，鸟嘌呤及其代谢酶在癌症和衰老中起着重要作用。腺苷与衰老相关的神经退行性疾病有关，研究发现大脑皮层中的腺苷参与代谢并影响AD小鼠的神经退行。研究表明，3′，5′-环磷酸腺苷（cAMP）可触发细胞级联反应。其介导的CREB信号通路可以影响影响学习和记忆能力的长期神经元可塑性。此外，由其衍生的磷酸二酯酶抑制剂可以用作治疗认知障碍的药物。GMP是RNA的一个组成部分，也是重要的第二信使。许多研究证实，它可以影响NOS的活性，并在衰老过程中调节大脑的认知、学习和记忆能力。

这表明肠道细菌可能通过影响嘌呤代谢和调节氧化应激的关键代谢产物来改善认知障碍和延缓大脑衰老。然而，这一结论需要进一步的研究验证。对于那些涉及显著差异的途径，除了嘌呤代谢外，甘油磷脂代谢与阿尔茨海默症的病理生理学显著相关。此外，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢是一种与年龄相关的代谢途径，可增强抗氧化和抗衰老能力。类似地，最近的研究表明牛磺酸和亚牛磺酸可以调节衰老。

然而，我们的研究存在几个局限性，首先，我们的样本数量不够大。其次，我们没有使用粪便移植或无菌小鼠来验证肠道细菌的真正作用。最后，我们探讨了微生物和代谢产物标记物如何影响氧化应激的具体机制，学习和记忆能力仍需要深入研究。

结论

总之，我们的研究证实了PSP通过D-半乳糖诱导的衰老小鼠的“微生物群-肠道-大脑”轴减轻氧化应激和病理变化并改善认知功能的能力。此外，我们的研究表明，拟杆菌门和厚壁菌门以及嘌呤代谢显著丰富的差异代谢产物的变化可能与氧化应激和认知功能有关，值得进一步研究。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464623000762

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