视网膜色素变性（RP）是一种以渐进性光感受器细胞及色素上皮细胞功能丧失的视网膜变性类疾病，具有典型的遗传异质性。其中，神经细胞PDE6B基因突变是引起视网膜色素变性的主要原因之一。
全球范围，视网膜色素变性的发病率约为 1/4000，最早的发病年龄仅有 2 岁，患者发病后一年之内可能完全失明，然而，现阶段尚未开发出可以有效治疗视网膜色素变性的药物。
近期，武汉科技大学姚凯教授团队设计开发出一种“通用型基因编辑工具”，并通过这种新型工具逆转了 RP 小鼠的视力损失。目前，这项研究成果已经以“Vision rescue via unconstrained in vivo prime editing in degenerating neural retinas”为题发表在Journal of Experimental Medicine上。
（来源：Journal of Experimental Medicine）
“我们构建的这种‘通用型基因编辑工具’克服了传统基因编辑工具的一些缺陷，不受基因突变类型和基因突变位置的限制，能够对全基因组进行‘无限制’地纠正，而且这也是国际首次在成体动物上成功实现无限制性基因编辑。”武汉科技大学姚凯教授告诉生辉。
姚凯博士毕业于香港中文大学，随后赴美国耶鲁大学从事博士后研究，围绕视网膜相关疾病的致病机制开展研究工作。2017 年，他回国并进入武汉科技大学。截至目前，他的研究成果已在Nature、JEM、Nature Cell Biology、Cell Reports、PNAS等国际顶级期刊发表，主持建立了武汉科技大学“视神经科学与干细胞工程”研究院，这是全国首个以高校为依托的视觉科学研究院。
现在，姚凯是武汉科技大学视神经科学与干细胞工程研究院院长、教授、博士生导师，他课题组的研究方向主要围绕视觉神经退行性疾病机制，以及干细胞治疗与基因治疗神经退行性疾病等。
▲图｜武汉科技大学视神经科学与干细胞工程研究院姚凯教授（来源：受访者）
开发通用型基因编辑工具，理论适用于所有遗传疾病
如今，随着基因编辑技术的发展已经开发出碱基编辑（Base Editor，BE）、先导编辑（Prime Editor，PE）等工具。就目前而言，基因编辑工具大都存在一些使用限制。“PAM 序列限制是当前基因编辑工具普遍存在的一个问题，即只有存在 PAM 序列时编辑工具才能发挥作用，一旦基因突变附近没有合适的 PAM 序列编辑工具就无法使用。”姚凯指出。
PAM 序列
CRISPR 靶向特异性由两部分决定，一部分是 RNA 嵌合体和靶 DNA 之间的碱基配对，另一部分是 Cas9 蛋白复合体和一个短 DNA 序列，这个短的 DNA 序列通常在靶 DNA 的 3' 末端作用，被称为前间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）。
“除此之外，以碱基编辑工具为例，其只能编辑单一的碱基突变，若是出现两个或更多突变就难以应对。”姚凯说道，“因此，我们想开发出一种新的编辑工具，既不受基因突变类型的限制，也不受突变位点的限制。”
“原始的先导编辑工具以 SpCas9 为基础，在这项新研究中，我们把 SpCas9 替换成了 SpRY，将先导编辑与无 PAM 序列限制的 SpRY 相结合并构建成一个融合蛋白，从而开发出了这种无约束性的体内基因先导编辑工具，我们将其称之为PESpRY。”姚凯表示，“这种编辑工具大幅降低了对 PAM 序列的依赖性，基本能够实现全基因组的识别。”
据介绍，先前已有研究团队采用基因编辑工具恢复了患有先天性黑蒙症的小鼠的视力，并将其推进到临床试验阶段。“当时的研究所针对的是视网膜色素上皮细胞，并不是神经细胞。”姚凯指出，“我们此次是针对神经细胞进行的基因编辑，尤其是对于濒临死亡的神经细胞，而且还是采用‘无限制的先导编辑工具’，这两项突破创新在国际层面都属于首次。”
▲图｜基因编辑治疗后的小鼠视网膜中的光感受器保留（来源：Journal of Experimental Medicine）
“患有视网膜色素变性的小鼠在刚出生时视力正常，但由于存在基因突变，它成长过程中最终会完全失明。”姚凯说道，“基于该小鼠模型，我们利用这种编辑工具在视网膜色素变性疾病中对突变的基因进行了矫正，经过治疗后，小鼠视觉能力几乎恢复到正常水平。”他补充说。
“虽然我们的这项研究是以视网膜色素变性这种疾病开展的研究与治疗，但是这种通用型基因编辑工具可以拓展到几乎所有的人类遗传性疾病。”姚凯指出，“无基因突变类型和位置限制是基因编辑工具所追求的一种终极形式，而我们此次开发的这种新工具已经非常接近于最终版本。”他补充说。
据悉，这篇论文的发表引起了科学界的广泛关注。美国国家科学院院士、眼科专家Krzysztof Palczewski教授和加州大学Samuel W.Du在同期发表评论文章称，“这种基因编辑工具的适用性远超眼睛，理论上可以用于几乎所有的人类遗传疾病。”美国哈佛大学与 Broad 研究所刘如谦教授也表示，“这项研究有效地纠正了视网膜神经细胞的PDE6B基因突变，保护了光感受器并挽救了视觉功能”。
▲图｜基因编辑治疗后小鼠视力得到改善（来源：Journal of Experimental Medicine）
关于下一步的研究动向，姚凯表示，“PDE6B基因突变是引发视网膜色素变性的主要原因之一，其在人类的视网膜色素变性疾病中大概占 5% 左右，但是该疾病可由百余种不同的基因突变引发，所以我们希望下一步把它应用于更多基因突变类型的视网膜色素变性的治疗中。”他说道。
“除此之外，虽然理论上这种基因编辑工具可以拓展到各种遗传病，但是落地到临床应用前还需要通过大量的前期试验进行验证。”姚凯说道，“我们接下来会进一步优化该编辑工具，尤其是安全性方面，降低脱靶效应直到可以忽略不计，届时就可以推进到临床阶段。”
未来有望开发成新型基因药物造福失明患者
从耶鲁大学到武汉科技大学，姚凯长期从事神经生物学领域的研究工作，专注于针对视网膜退行性疾病的干细胞/基因治疗的开发。
2018 年，姚凯以第一作者在Nature上发表了题为“Restoration of vision after de novo genesis of rod photoreceptors in mammalian retinas”的论文，他和团队首创“基因治疗两步法”，采用内源性干细胞并诱导其再生为视网膜感光细胞，从而让先天失明的小鼠重新恢复视力。
（来源：Nature）
他们这项干细胞/基因治疗领域的新发现改变了“哺乳动物视觉神经系统难以再生”的传统观念，为包括视网膜色素变性、老年黄斑变性、糖尿病视网膜病变等视神经疾病，以及阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的治疗提供了理论基础。
彼时，Nature杂志的评委称该项研究是“干细胞和基因治疗领域的突破性成果，尤其是在利用内源性干细胞治疗遗传性疾病方面取得了创造性的发展。”值得一提的是，当时这项研究成果还入选了由中国科学院与中国工程院两院院士评选的“2018 年世界十大科技进展新闻”。
（来源：Pixabay）
对比前后两项研究，在姚凯看来，“虽然都是遗传性疾病，但是也存在一些区别，早先发表在Nature上的研究，治疗的是先天性失明的小鼠，而此次发表在Journal of Experimental Medicine上的研究，治疗的是后天性失明的小鼠，这两项研究成果都具有很大的转化潜力。”他表示。
对于此次的新研究成果，姚凯表示，“最终有望开发成一种全新的基因治疗药物，通过眼部注射的方式最快 2 周即可逆转视力损失，让失明患者复明，同时，我们也迫切希望未来能够早日实现技术转化，造福更多患者。”他总结道。
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