谷氨酸是脊椎动物大脑中最丰富的神经递质，每立方微米的神经纤维网大约就有一个谷氨酸能突触。尽管如此紧密的堆积，突触谷氨酸信号传导很少引起串扰。突触通过离子型谷氨酸受体的动力学和定位来实现这种空间特异性。
基于强度的谷氨酸感应荧光报告（iGluSnFR）及其变体已被广泛用于对突触活动进行成像，包括自发和诱发的量子释放（quantal release），以及突触外信号。然而，现有的iGluSnFR变体在体内具有低信噪比（SNR），限制了可以同时监测的突触数量。其次，iGluSnFR信号采集的空间范围很大，因此，仅通过iGluSnFR测量，尚不清楚信号是来自突触伴侣还是附近未连接的轴突。此外，实验还表明，iGluSnFR的膜显示构建体（PDGFR）对突触后的纳米定位较差；轴突上的信号大于树突，与突触后蛋白的融合增加了低亲和力变体的信号。
基于以上局限性，近日，美国霍华德·休斯医学研究所Kaspar Podgorski研究团队在Nature Methods发表研究，通过设计和优化iGluSnFR变体，提高了突触与突触外谷氨酸信号的敏感性和特异性。
1、iGluSnFR3设计
研究人员在细菌、纯化蛋白和培养神经元中进行20轮诱变和筛选，通过高通量分析来丢弃不需要的变体。通过测量亲和力、pH响应、量子产率、消光系数、2P光谱、荧光相关光谱（FCS）和停流动力学。选择了iGluSnFR3.v857（“v857”，与WT相比有15个突变），因为它具有高Kfast、快速的细胞动力学、亮度、部分荧光响应（ΔF/F0）和光稳定性。同时也选择了密切相关的变异体iGluSnFR3.v82进行比较，它的动力学特性不太利于突触特异性。
通过实验比较，确定v857是一种敏感、选择性的iGluSnFR变体，具有快速的神经元动力学和高Kfast。v82是一种敏感、选择性的变体，与v857相比，它具有更高的亲和力、更慢的神经元动力学和更低的Kfast：这些特性应该使它对突触外谷氨酸更敏感。
Figure 1 iGluSnFR3变体的光物理性质
2、体外培养神经元中突触信号的成像
通过使用宽场成像监测培养神经元之间突触处自发和诱发谷氨酸释放的信号，来表征敏感性、空间特异性和饱和度。实验结果表明，v857能更线性地报告单个突触的谷氨酸释放，并更好地区分培养神经元中的突触和突触外信号[Fig.2]。
Figure 2 成像和操纵突触释放
此外，研究人员还评估了这些功能改进的构建体的纳米级定位。将编码v857的Cre依赖性SGZ、GPI和PDGFR变体的腺相关病毒（AAV）注射到Emx1-Cre小鼠的皮层中。结果确定v857增加突触信号SNR、改善培养神经元的运输和改善iGluSnFR在体内突触后定位的基序。
Figure 3 膜靶向序列对突触反应和定位的影响
3、体内iGluSnFR3成像和电生理学
接下来，研究人员对小鼠视觉皮层中的iGluSnFR3信号进行了表征。结果发现在注射编码v857.GPI或v857.PDGFR变体的AAVs的小鼠中观察到强信号，以及相对于WT增加的光稳定性。电生理学确定表达v857的神经元表现出更大、更快的单个AP相关瞬态[Fig.4]。
此外，使用iGluSnFR3的高信噪比和直接波前传感自适应光学2P（AO2P）显微镜克服了精确测量桶状皮层L4的深度（约350–450 μm）和小突触体积（<1 femtoliter）突触活动的挑战。
Figure 4 视觉皮层的体内成像和电生理
总结与展望
本研究通过在细菌、可溶性蛋白和培养的神经元中进行多途径筛选，开发了具有改善的信噪比和动力学的变体，改善了iGluSnFR在突触后的纳米定位。由此产生的指示剂iGluSnFR3表现出快速的非饱和激活动力学。
iGluSnFR3提供了优于先前方法的优点。它的低动力学饱和度使以前被饱和效应混淆的定量测量变得更加容易。它的信噪比、动力学和空间特异性允许从突触群体中进行记录，同时解决单个输入时间上的毫秒差异。这些能力将允许观察神经元计算和学习理论的突触动力学。
https://doi.org/10.1038/s41592-023-01863-6
参考文献
Aggarwal, Abhi et al. “Glutamate indicators with improved activation kinetics and localization for imaging synaptic transmission.” Nature methods, 10.1038/s41592-023-01863-6. 4 May. 2023, doi:10.1038/s41592-023-01863-6
编译作者：Young（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）
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