柠檬烯是一种植物来源的挥发性单萜化合物，化学特性稳定，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗菌等生物活性，广泛应用于医药产品、香料、化妆品、食品添加剂以及生态友好型农药中。
根据资料，预计到 2024 年，柠檬烯的全球市场规模将超过 19 亿美元。在需求大幅度增长的情况下，仍需要进一步提升柠檬烯的产能。
相比于传统的植物提取和化学合成方法，微生物发酵法能够有针对性地、高效地、可持续地生产柠檬烯，并且已有大量的研究资料，细菌、酵母和霉菌都已经成功地用于柠檬烯的生物合成。
到目前为止，关于柠檬烯合成的研究大多集中于加强 MVA 途径，削弱竞争性旁路以及优化柠檬烯合成酶等方面。
近日，江南大学团队尝试使用“优化关键基因”、“调整代谢流”、“增加前体和辅助因子供应”、“线粒体区室化工程”、“优化培养条件”的一系列系统的代谢工程策略在酿酒酵母中高效生物合成柠檬烯，并获得截至目前酿酒酵母中的最高滴度，达 2.63 g/L。研究文章以题“Efficient Synthesis of Limonene in Saccharomyces cerevisiae Using Combinatorial Metabolic Engineering Strategies”发表于Journal of Agricultural and Food Chemistry杂志。
常规策略：优化关键基因和调整代谢流
香叶基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）是萜类的直接前体之一。传统的工程酿酒酵母生物合成柠檬烯的途径是，由外源的柠檬烯合成酶利用内源的 GPP 合成，但柠檬烯的产量较低。
在这一过程中，由LimS编码的柠檬烯合成酶起着至关重要的作用，而柠檬烯合成酶的截断突变体（tLimS）表现出较高的催化活性。
首先，研究人员通过引入来自Mentha spicata的tLimS，实现了由 GPP 生物合成柠檬烯，得到的滴度为 46.96 mg/L。
为了优化柠檬烯的从头合成，研究人员首先要确保柠檬烯生物合成的前体供应充足，于是他们让编码 MVA 途径的两个限速酶被过量表达。
▲图丨柠檬烯在酿酒酵母中的合成途径。（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
在柠檬烯合成途径的关键分支中存在代谢流竞争。
在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，一种由ERG20编码的内源性双功能酶同时具有二甲基烯丙基转移酶和香叶基转移酶的活性。ERG20 首先催化二甲基烯丙基二磷酸酯（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）和异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）合成 GPP，随后催化 GPP 和 IPP 生成法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）。
也就是说，GPP 一旦合成，随后便被 ERG20 转化为 FPP，也就是合成柠檬烯的前体减少了。通常来说会采取敲除ERG20的手段，但ERG20是一个重要的基因，而且ERG20缺失的突变株是不能存活的。
▲图丨MVA 途径相关基因增强及ERG20基因调控示意图（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
于是，为了让代谢流转向柠檬烯的合成，研究人员在 GPP 前体转化为柠檬烯的反应步骤中采用了"推-拉-限"策略。
▲图丨"推-拉-限 "策略示意图（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
具体来说，动态抑制 ERG20 调节的关键代谢分支的竞争性旁路，包括用葡萄糖诱导型启动子HXT1替换ERG20的启动子，以及引入ERG20抑制蛋白。随后，通过增加tLimS的拷贝数，加强了柠檬烯的合成途径以拉动代谢流。
亮点策略：优化 NADPH 供应和线粒体区室化
随着柠檬烯合成强度的增加，另一个限制是乙酰辅酶 A 和 NADPH 供应不足。
合成一分子的柠檬烯需要六分子的乙酰辅酶 A 和四分子的 NADPH，因此，前体乙酰辅酶A的含量 和 NADPH 是限制柠檬烯合成的关键因素。
前面提到，研究人员通过过度表达MVA 途径来增加柠檬烯的合成，该策略会导致细胞 NADPH 池的耗尽，从而损害细胞内氧化还原平衡和途径效率。因此，研究人员增加了乙酰辅酶 A 和 NADPH 的供应，将柠檬烯滴度提高到 1097.43 mg/L。
这证实了乙酰辅酶 A 和辅助因子对柠檬烯生物合成的重要性，而在此之前，优化 NADPH 以提高柠檬烯合成尚未见报道。
▲图丨柠檬烯合成前体 NADPH 和乙酰辅酶 A 在酿酒酵母中的代谢途径示意图。绿色和红色表示基因的过度表达和敲除（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
最后，研究人员重建了线粒体中柠檬烯的合成途径。
此前已有研究利用线粒体、过氧化物酶体和内质网对合成途径进行区隔，以提高各种异戊二烯的产量。代谢途径的分区可以提高局部酶的浓度，也可以为酶和产品的储存提供适应性的生理和生化环境。
不过此前还没有利用线粒体区室化生产柠檬烯的报道。
除了上面提到的优点，线粒体还具有较高的还原氧化电位，丰富的三磷酸腺苷（ATP），以及生化反应所需的足够的辅助因子，这也使其成为除细胞质外合成柠檬烯的绝佳场所。
MVA 途径和柠檬烯合成途径中的酶被整合到线粒体中，以调节柠檬烯的细胞质和线粒体的合成途径，此策略进一步将柠檬烯滴度提高到 1586 mg/L，这表明线粒体区室化是促进柠檬烯生物合成的有效策略。
▲图丨分区工程原理图（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
需要注意的是，当柠檬烯的滴度超过 213.8 mg/L 时，会对酿酒酵母细胞的生长产生毒性抑制，因此，需要在细胞生长和产物合成之间取得适当的平衡。
研究人员采用了两阶段发酵策略，以减少放大生产过程中柠檬烯的毒性，即通过控制葡萄糖的供应，实现了细胞生长阶段和柠檬烯积累阶段的转换，从而在保证细胞正常生长的同时最大限度地提高产品的合成。
具体来说，在细胞生长阶段，提供高的葡萄糖水平以触发ERG20的高表达水平和tLimS的低表达水平，从而促进细胞生长；在柠檬烯积累阶段，根据ERG20和tLimS表达的变化，将葡萄糖保持在低水平，使碳代谢流从角鲨烯合成转向柠檬烯合成。
优化补料分批发酵方法后，在 3 L 发酵罐中柠檬烯滴度达到 2.63 g/L，为目前报道的酿酒酵母最高滴度，产量为 0.028g/g 葡萄糖。
写在最后
在文章的讨论中，作者指出：
1、本研究采用的两阶段发酵策略可以为其他有毒生物制品提供参考。研究结果可以为柠檬烯及其衍生物的生物合成奠定基础，并为酿酒酵母工业化生产柠檬烯铺平了道路；
2、线粒体具有丰富的前体乙酰辅酶 A 和 ATP，可作为萜类化合物合成调控的第二位点。结合已有研究，与细胞质相比，线粒体可能是更适合生产柠檬烯的地方；
3、研究结果表明，对细胞质和线粒体代谢的双重调节是一种有前途的柠檬烯合成方法，并且可以为其他天然产品的合成提供参考；
4、研究结果揭示了优化合成途径以实现柠檬烯的从头合成和产量积累的必要性，在接下来的研究中，将修改柠檬烯合成酶以及HMG1和IDI1编码的两个限速酶的结构。
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